桑樹(shù)原生質(zhì)體分離及融合的研究.pdf

1、桑樹(shù)為多年生木本植物，其生長(zhǎng)及育種周期較長(zhǎng)，雖然桑樹(shù)可以通過(guò)扦插來(lái)擴(kuò)大栽培面積，但不能保證桑樹(shù)免受病毒感染和優(yōu)良種質(zhì)的延續(xù)。隨著植物細(xì)胞工程的迅猛發(fā)展，通過(guò)植物細(xì)胞工程來(lái)改良桑樹(shù)品種已經(jīng)成為現(xiàn)代桑樹(shù)育種的一個(gè)必然趨勢(shì)。目前對(duì)于桑樹(shù)的細(xì)胞工程研究多集中在組培快繁、外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因等。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行桑樹(shù)育種的研究少有報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)以桂桑優(yōu)12號(hào)、農(nóng)桑14號(hào)和新桑11號(hào)的組培苗為材料，進(jìn)行了桑樹(shù)原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)及

2、其融合的研究，初步篩選出了適合桑樹(shù)原生質(zhì)分離與純化、培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合及雜種篩選等的條件和方法。旨在為桑樹(shù)體細(xì)胞雜交育種研究和種質(zhì)資源保護(hù)等提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.明確了桑樹(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)條件，確定了胚型愈傷組織的獲得方法。幼嫩的桑樹(shù)莖段適合愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2，4-D2mg/L；愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D2mg/L，經(jīng)過(guò)3次繼代，可得到淡黃色、結(jié)

3、構(gòu)松脆的胚性愈傷組織。
　　 2.建立了桑樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，研究了培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基配方、初始接種量、搖床轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度、換液量、繼代周期、培養(yǎng)過(guò)程中pH值變化等因素對(duì)桑樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的影響。確定了桑樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳條件；以桂桑優(yōu)12號(hào)的幼嫩胚性愈傷組織作為材料，在液體培養(yǎng)基B5+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L上，附加蔗糖40g/L，培養(yǎng)瓶的裝液量為25mL/50mL，每瓶接種PCV量為1mL，轉(zhuǎn)速為17

4、5rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)，每5d繼代1次，每次換液量為15mL。培養(yǎng)21d時(shí)，桑樹(shù)細(xì)胞產(chǎn)量最高，達(dá)98.1mg/L，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快，達(dá)183.3mg/(L·d)。
　　 3.明確了酶液組成成分與濃度對(duì)桑樹(shù)原生質(zhì)體分離有很大的影響。試驗(yàn)采用100U/mL纖維素酶R-10、150U/mL果膠酶Y-23和6U/mL離析酶R-10組合酶液來(lái)分離原生質(zhì)體，其中添加了細(xì)胞-原生質(zhì)體洗液(1480mg/LCaCl2·2H2O，27.2mg/

5、LKH2PO4)，以0.6mol/L甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，在28℃酶解溫度條件下酶解6h，用桑樹(shù)胚性懸浮細(xì)胞作分離材料可獲得7.8＋106個(gè)/g的原生質(zhì)體產(chǎn)量，且原生質(zhì)體活力達(dá)91.4％。
　　 4.優(yōu)化了桑樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本條件和方法。將分離純化后的桑樹(shù)原生質(zhì)體用KPR液體培養(yǎng)基稀釋至1×105個(gè)/mL，然后在附加6-BA1.0mg/L和2，4-D0.2mg/L，以0.6mol/L葡萄糖作為滲透劑的KPR培養(yǎng)基上，采用低熔

6、點(diǎn)瓊脂糖包埋培養(yǎng)。在第5～6d可以看到第一次細(xì)胞分裂，第13～17d時(shí)發(fā)生大量的細(xì)胞分裂，培養(yǎng)15d時(shí)，桑樹(shù)原生質(zhì)體的分裂頻率最高，達(dá)9.88%，植板率達(dá)4.96%。
　　 5.試驗(yàn)采用PEG-高Ca2+高pH法誘導(dǎo)桂桑優(yōu)12號(hào)原生質(zhì)體和農(nóng)桑14號(hào)原生質(zhì)體進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)融合。融合前將供體和受體材料分別進(jìn)行UV輻射處理和IOA處理，研究UV輻射和IOA對(duì)原生質(zhì)體分裂及生長(zhǎng)鈍化作用，結(jié)果表明將供體桂桑優(yōu)12號(hào)原生質(zhì)體進(jìn)行輻射強(qiáng)度300μ

7、W/(cm2)時(shí)，處理時(shí)間6min為宜；將受體農(nóng)桑14號(hào)原生質(zhì)體用16mmol/LIOA處理10min鈍化。在桑樹(shù)原生質(zhì)體的融合過(guò)程中，誘導(dǎo)劑的分子量和濃度、處理時(shí)間和原生質(zhì)體密度等對(duì)原生質(zhì)體都有影響。試驗(yàn)選用PEG6000濃度為35%時(shí)，在原生質(zhì)體密度為0.5×105個(gè)/mL中誘導(dǎo)處理15min時(shí)，桑樹(shù)原生質(zhì)體聚合率達(dá)51.47%，且對(duì)桑樹(shù)原生質(zhì)體的融合效果好。對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行再培養(yǎng)，2h后可以觀(guān)察到原生質(zhì)體的聚集，培養(yǎng)25～3