高產(chǎn)埃博霉素纖維堆囊菌的genome shuffling選育研究.pdf

1、埃博霉素(epothilone)是纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。與傳統(tǒng)的抗癌藥物紫杉醇相比,埃博霉素能夠更好地抑制腫瘤細胞增殖,且分子結(jié)構(gòu)簡單、水溶性好、毒副作用小、抗腫瘤譜廣、可發(fā)酵生產(chǎn),是一種具有重要開發(fā)潛力的新型抗腫瘤活性物質(zhì)。然而,由于人們對纖維堆囊菌的遺傳背景認知不足、遺傳操作系統(tǒng)低效及缺乏有效的遺傳標記等問題,針對纖維堆囊菌的遺傳改造及埃博霉素的異源表達都遇到了極大的困難,因此采用常規(guī)手段對其進行菌種

2、選育仍是目前提高埃博霉素產(chǎn)量的主要方法。
　　Genome shuffling是近年來提出的一種簡便、高效的菌種改良方法,以多輪遞歸原生質(zhì)體融合為依托,將不同親本的優(yōu)良性狀高效地整合到融合子中,借助高通量篩選方法可以在較短時間內(nèi)獲得性狀顯著改良的突變株,目前已在多種工業(yè)菌株的選育中得到了證實。本文從纖維堆囊菌野生菌株So0157-2出發(fā),通過pH、前體及產(chǎn)物耐受選育、分散生長馴化和genome shuffling選育技術(shù),結(jié)合適當

3、的高通量篩選方法對大量菌株進行了篩選,得到了埃博霉素產(chǎn)量顯著提高的菌株。
　　主要工作如下:
　　1、通過對野生菌株的pH耐受選育和基于前體、產(chǎn)物兩步推理選育獲得高產(chǎn)型菌株P(guān)e107,其埃博霉素A、B產(chǎn)量分別提高至出發(fā)菌株的227.0％和210.3％,且基本保留了耐受pH和高濃度前體、產(chǎn)物的優(yōu)良性狀。
　　2、由于纖維堆囊菌在液體培養(yǎng)時具有聚團生長的特征,不利于發(fā)酵,本文通過對具有分散生長趨勢的pH耐受突變株進行上清傳

4、代馴化,獲得分散生長型菌株L4-29。雖然發(fā)酵過程其菌體總量和產(chǎn)量明顯降低,但其液體種子菌液幾乎為渾濁均一的液體,分散度約為野生菌株的10倍。
　　3、隨后探索了纖維堆囊菌原生質(zhì)體的制備、再生、滅活以及融合條件。確定制備條件為種齡3天,PBS洗滌2次,終濃度14％的甘露醇為高滲液,15％EDTA預(yù)處理30min后添加3g·L-1溶菌酶酶解90min;再生條件為高滲液洗滌殘留酶液3次,然后以含10％高滲成分的M26液體培養(yǎng)基復(fù)壯24

5、h,再用含10％高滲成分的0.25％水瓊脂懸浮菌體后傾倒于VY/2再生固體培養(yǎng)基上層;滅活條件為距離30W紫外燈5cm處紫外照射滅活分散生長型親本4min,55℃水浴熱滅活高產(chǎn)型親本10min;融合條件為添加30％PEG、30℃水浴融合6min。
　　4、采用上述原生質(zhì)體融合條件,以高產(chǎn)型菌株P(guān)e107和分散生長型菌株L4-29為親本進行g(shù)enome shuffling選育。獲得高產(chǎn)型融合菌株Gc16,其埃博霉素A、埃博霉素B產(chǎn)量

6、分別提高至高產(chǎn)型親本的117.9％和117.1％,且為野生菌株的267.6％和246.2％。
　　5、分析了96孔板微培養(yǎng)和微板光譜儀分析相結(jié)合的埃博霉素B高產(chǎn)菌株快速篩選方法的可行性。待測菌株采用96孔板微量固體發(fā)酵,四氯化碳浸提發(fā)酵產(chǎn)物,經(jīng)微板光譜儀測定OD249、HPLC產(chǎn)量檢測結(jié)合SPSS軟件分析,埃博霉素B含量與OD249具有較好的相關(guān)性,OD249數(shù)值位于前20％的菌株可用于復(fù)篩。樣品浸提液中埃博霉素B含量及OD249