纖維堆囊菌合成埃博霉素幾個(gè)關(guān)鍵問題的研究.pdf

1、粘細(xì)菌是一類以滑動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)，可以形成種類豐富、功能多樣的生物學(xué)活性物質(zhì)，具有復(fù)雜多細(xì)胞社會(huì)學(xué)行為的革蘭氏陰性桿菌。粘細(xì)菌所具有的社會(huì)學(xué)行為以及能夠分化形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)的能力是區(qū)別于其他原核生物的主要特點(diǎn)。
　　 纖維堆囊菌是粘細(xì)菌中一類能夠降解纖維素的生理類群，具有極其優(yōu)異的生物學(xué)合成能力，發(fā)現(xiàn)由其產(chǎn)生的的次級(jí)代謝生物學(xué)活性物質(zhì)占到了從粘細(xì)菌中總發(fā)現(xiàn)量的48.4％。纖維堆囊菌的社會(huì)性行為表現(xiàn)為在生長(zhǎng)過程中呈現(xiàn)出聚團(tuán)生長(zhǎng)和細(xì)胞密度依

2、賴性的特點(diǎn)，再加上纖維堆囊菌代時(shí)長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，這些特性嚴(yán)重限制了纖維堆囊菌的分離純化工作，如纖維堆囊菌埃博霉素生物合成改造后期突變株的分離純化。
　　 在本文的工作中，我們以纖維堆囊菌為研究對(duì)象，在山東大學(xué)粘細(xì)菌與醫(yī)藥微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室建立的微包埋培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上將分散至單細(xì)胞狀態(tài)的纖維堆囊菌單細(xì)胞包埋在海藻酸鍶凝膠球粒中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)纖維堆囊菌細(xì)胞的包埋。我們以被包埋的纖維堆囊菌菌株自身作為助長(zhǎng)菌株，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期得到的埃

3、博霉素誘變株進(jìn)行包埋純化。最終我們得到了具備突變株遺傳特性的、埃博霉素產(chǎn)量存在顯著差異的多個(gè)單克隆。微包埋技術(shù)克服了傳統(tǒng)的分離純化纖維堆囊菌效率低、耗時(shí)長(zhǎng)的弊端，大大加快了纖維堆囊菌次級(jí)代謝途徑改造的工作進(jìn)程，提高工作效率。
　　 埃博霉素是纖維堆囊菌合成的一類具有促微管聚合活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由于其抗腫瘤活性成為人們研究的熱點(diǎn)之一。目前有多種埃博霉素類似物進(jìn)入臨床評(píng)估階段，其中Ixabepilonelaos已經(jīng)在美國(guó)成功上

4、市。但是由于纖維堆囊菌埃博霉素產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴等因素制約了埃博霉素的生產(chǎn)，樹脂就是其中一個(gè)重要因素。目前不論是小型實(shí)驗(yàn)還是上罐發(fā)酵所用的埃博霉素吸附樹脂都是美國(guó)羅門哈斯進(jìn)口的XAD-16大孔吸附樹脂，這種樹脂價(jià)格昂貴，用量較大，提高了埃博霉素的生產(chǎn)成本。本文分析了40種不同類型的國(guó)產(chǎn)吸附樹脂對(duì)纖維堆囊菌So0157-2產(chǎn)埃博霉素的影響，結(jié)果顯示其中4種可以提高埃博霉素的產(chǎn)量，一種可以顯著促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)。復(fù)合樹脂實(shí)驗(yàn)則證明不同優(yōu)勢(shì)樹脂混合

5、使用的效果遠(yuǎn)大于單一樹脂，其中大孔型強(qiáng)堿陰離子交換樹脂D202與大孔吸附樹脂XD-5以3:7比例混合使用效果最佳，可以使So0157-2的埃博霉素產(chǎn)量較XAD-16提高8.3倍。
　　 天然的埃博霉素主要以埃博霉素A和埃博霉素B兩種形式存在，我們把產(chǎn)生埃博霉素的菌株根據(jù)其epothioneA/B合成比例情況分為epo B+和epoB-兩個(gè)種類。通過比較10株纖維堆囊菌的ATmodC2核酸、氨基酸序列信息及同源建模蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)水

6、平的差異，找出四個(gè)可能會(huì)對(duì)ATmodC2底物選擇造成差異的氨基酸位點(diǎn)（Val90,Ala91,Ala95,Ser196），這四個(gè)氨基酸位點(diǎn)在空間分布上均位于活性反應(yīng)中心Ser94及Arg119的附近。我們將這四個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變?yōu)長(zhǎng)eu90,Val91,Ile95,Phe196，并進(jìn)行ATmodC2的 E.coli異源表達(dá)及包涵體蛋白復(fù)性。ATmodC2酶活測(cè)定結(jié)果表明，這4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變?cè)斐葾TmodC2對(duì)methylmalony-

7、CoA的結(jié)合能力降低了近80％。而單一位點(diǎn)突變的M95，M196反應(yīng)后MM/M為別為0.58和0.30，說明突變子結(jié)合甲基丙二酰輔酶A的能力分別下降至結(jié)合丙二酰輔酶A的58％和30％，從這個(gè)結(jié)果我們可以看到196位點(diǎn)Ser替換為Phe后對(duì)甲基丙二酰輔酶A的結(jié)合能力影響很大。實(shí)驗(yàn)室前期工作中提出的2個(gè)新位點(diǎn)90,91聯(lián)合突變子M90-91的MM/M值為0.35，說明這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)于甲基丙二酰輔酶A的結(jié)合確實(shí)有一定的影響，且影響程度與95,1