纖維堆囊菌GSUV3-205發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素過程中關(guān)鍵因子的探索及優(yōu)化.pdf

1、粘細(xì)菌是一類具有復(fù)雜多細(xì)胞社會學(xué)行為的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠合成多種具有抗腫瘤、抗真菌、抗細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的天然產(chǎn)物。研究人員已經(jīng)從粘細(xì)菌次級代謝物中鑒定出100多種基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和500多種結(jié)構(gòu)類似物。微生物來源的小分子物質(zhì)中約有3.5％來源于粘細(xì)菌，粘細(xì)菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性甚至可以與著名的鏈霉菌類群和芽孢桿菌類群相比擬。
　　 纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)屬于粘球菌目、堆囊菌亞

2、目、多囊菌科、堆囊菌屬，可以通過降解纖維素進(jìn)行生長。據(jù)我們了解，纖維堆囊菌擁有迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的原核生物基因組，如纖維堆囊菌So ce56的基因組大小約為13Mb。目前研究結(jié)果顯示，在龐大的基因組中有大量基因被”奢侈”的用來進(jìn)行次級代謝，它合成的次級代謝產(chǎn)物幾乎占所有已發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌種類的一半，并且?guī)缀?00％的菌株都具有合成生物學(xué)活性物質(zhì)的能力。因此，纖維堆囊菌不但具有重要的基礎(chǔ)研究價值，而且還具有誘人的應(yīng)用開發(fā)前景。
　　 埃

3、博霉素(epothilones)是粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產(chǎn)生的一類聚酮類次級代謝產(chǎn)物。與目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇相比，它具有相似的穩(wěn)定微管活性，而且對紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞具有活性。目前至少有五個埃博霉素類化合物(ixabepilone，patupilone，BMS-310705，KOS-862和ZK-EPO)已經(jīng)進(jìn)行了Ⅰ-Ⅲ期臨床實(shí)驗，而且目前已經(jīng)有一種產(chǎn)品(ixabepilone)

4、得到了美國FDA的權(quán)威認(rèn)證。但是，目前埃博霉素的發(fā)酵生產(chǎn)能力成為該藥研發(fā)的一個主要瓶頸。
　　 菌株GSUV3-205是本實(shí)驗室通過Genome Shuffling技術(shù)得到的一株具有較高產(chǎn)量的埃博霉素產(chǎn)生菌，具有一定的的工業(yè)應(yīng)用前景。但是無論是GSUV3-205還是在國際上其他實(shí)驗室的發(fā)酵生產(chǎn)菌株，埃博霉素的實(shí)際生產(chǎn)量相對于發(fā)酵培養(yǎng)體系、底物利用率以及生物量都存在著轉(zhuǎn)化效率低的問題，它們還是有很大的提升空間的。而且，通過長時間的

5、傳代培養(yǎng)，重組菌株GSUV3-205的埃博霉素產(chǎn)生能力發(fā)生了很大的退化。因此，如何能夠在發(fā)酵體系中充分挖掘菌株的埃博霉素的合成能力成為研究者最為感興趣的問題之一，所以對于纖維堆囊菌合成埃博霉素過程中某些關(guān)鍵因子的研究，對纖維堆囊菌資源的開發(fā)利用和埃博霉素走向產(chǎn)業(yè)化都具有巨大的意義。
　　 本論文以本實(shí)驗室的一株埃博霉素產(chǎn)生菌纖維堆囊菌GSUV3-205為研究材料，以提高菌株的埃博霉素合成能力為主要目標(biāo)，主要從菌株的培養(yǎng)條件、營養(yǎng)

6、條件、生長狀態(tài)等方面分別進(jìn)行了一系列系統(tǒng)的改進(jìn)和優(yōu)化，并取得了良好的結(jié)果。
　　 對于每一種能夠合成有應(yīng)用價值的代謝產(chǎn)物的微生物來說，發(fā)酵過程改良都是從實(shí)驗室理論研究走向工業(yè)產(chǎn)業(yè)化道路的必要階段，因此本文的研究工作首先分兩個階段分別對埃博霉素產(chǎn)生菌纖維堆囊菌GSUV3-205的發(fā)酵培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 在第一階段，我們結(jié)合GSUV3-205的生理特性，主要對接種量、發(fā)酵時間、種子培養(yǎng)及接種的狀態(tài)、樹脂添加

7、時間、發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件因素進(jìn)行了系列考察。根據(jù)不同接種量下的埃博霉素產(chǎn)生曲線，確定了合適的接種量(5×109個細(xì)胞/50ml)和發(fā)酵培養(yǎng)時間(9天)；通過對不同接種量時不同種子培養(yǎng)接種狀態(tài)的埃博霉素的產(chǎn)量進(jìn)行分析，確定了最優(yōu)的種子培養(yǎng)接種狀態(tài)(種子200rpm培養(yǎng)5天)；通過單因子分析樹脂添加時間和發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速這兩個條件，得出了較有利于高產(chǎn)埃博霉素的條件，即滅菌時添加樹脂和200rpm發(fā)酵培養(yǎng)。
　　 第二個階段，我們利用

8、統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化方法中的響應(yīng)面設(shè)計法以epothilone B的產(chǎn)量為響應(yīng)值對GSUV3-205生產(chǎn)埃博霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。這個階段主要是通過兩個大的步驟來實(shí)現(xiàn)的。首先，我們在前期使用的EPM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了營養(yǎng)成分的拓展和初步優(yōu)化，即：利用單因子實(shí)驗考察了21種EPM培養(yǎng)基中不包含的營養(yǎng)成分對epothilone B合成的影響，獲得了7種較有利于合成埃博霉素的營養(yǎng)物質(zhì)；然后利用Plackett-Burman和Box-Behn

9、ken響應(yīng)面設(shè)計把通過單因子實(shí)驗拓展的7種營養(yǎng)成分和EPM培養(yǎng)基中原有的所有成分進(jìn)行了優(yōu)化，通過重要營養(yǎng)成分的數(shù)學(xué)建模和響應(yīng)面分析，獲得了一個初步優(yōu)化的培養(yǎng)基。其成分是：糊精0.3％、蔗糖0.05％、葡萄糖0.08％、大豆粉0.17％、脫脂奶粉0.1％、七水硫酸鎂0.1％、無水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液2ml/L、微量元素液0.5ml/L、pH7.2、吸附樹脂2％(v/v)?？梢钥闯觯cEPM培養(yǎng)基相比(土豆淀粉0.2％、葡

10、萄糖0.2％、大豆粉0.2％、脫脂奶粉0.1％、七水硫酸鎂0.1％、無水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液1ml/L、微量元素液1ml/L、VB120.5mg/l、pII7.2、吸附樹脂2％(v/v))，優(yōu)化培養(yǎng)基中復(fù)雜碳源由土豆淀粉換成糊精且增加了添加量，同時增加了一個新的簡單碳源即二糖物質(zhì)蔗糖，并對絕大部分成分的含量進(jìn)行了調(diào)整。利用這個培養(yǎng)基epothilone B的產(chǎn)量可以達(dá)到46.5mg/l，較原始產(chǎn)量11.3 mg/l提高

11、了3.1倍。此后，我們對初步優(yōu)化的培養(yǎng)基又進(jìn)行了進(jìn)一步的系統(tǒng)優(yōu)化：基于這個新的培養(yǎng)體系，利用FFD設(shè)計考察了這個體系各個組成成分對epothilone B產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)三個因子糊精(X2)、脫脂奶粉(X6)和硫酸鎂(x8)對epothilone B的產(chǎn)量具有顯著性影響。利用CCD這種五水平的響應(yīng)面設(shè)計法對這三個因素進(jìn)行了進(jìn)一步研究，建立了相應(yīng)的二次回歸模型：Y=51.69+17.03×X2+1.17×X6+0.70×X8-4.55×X

12、2×X2+7.01×X2×X6-2.48×X6×X6-0.69×X2×X8-2.01×X6×X8+0.52×X8×X8利用SAS8.0軟件的RSREG過程對這個模型的統(tǒng)計學(xué)意義進(jìn)行分析，說明了建立的數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗結(jié)果有好的相關(guān)性。通過模型可以看出糊精對于epothilone B的產(chǎn)量具有顯著影響，糊精和脫脂奶粉對epothilone B產(chǎn)量的影響具有較強(qiáng)的交互作用。最后獲得的優(yōu)化培養(yǎng)基成分為：糊精0.63％、蔗糖0.05％、葡萄糖0.0

13、8％、大豆粉0.17％、脫脂奶粉0.26％、七水硫酸鎂0.32％、無水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液2ml/L、微量元素液0.5ml/L、pH7.0、吸附樹脂2％(v/v)。So0157-2利用此培養(yǎng)體系發(fā)酵培養(yǎng)，可產(chǎn)生82.0mg/l的epothilone B，較初步優(yōu)化培養(yǎng)基(46.5mg/l)又提高了76.3％。這是首次在能夠產(chǎn)生埃博霉素的本源菌纖維堆囊菌中進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)酵過程優(yōu)化，并把GSUV3-205的埃博霉素產(chǎn)量水平提

14、高到了較高的水平，為下一步開展發(fā)酵罐中試和最終的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 本文隨后的工作結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報道，將有可能與纖維堆囊菌發(fā)酵合成埃博霉素過程密切相關(guān)的小分子物質(zhì)，梯度添加到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，探討了它們對GSUV3-205埃博霉素合成能力的影響。
　　 研究表明，鐵離子、甜菜堿類物質(zhì)以及埃博霉素合成的前體物質(zhì)乙酸鹽、丙酸鹽、甲基丙二酸、琥珀酸、半胱氨酸等物質(zhì)的過量添加，都會對GSUV3-205合成埃博

15、霉素的過程有抑制作用。但是在適當(dāng)?shù)奶砑訒r間和添加量時，這些小分子物質(zhì)的存在會促進(jìn)GSUV3-205埃博霉素的合成。比如，在發(fā)酵第三天添加0.05％的98％的鹽酸甜菜堿時，埃博霉素產(chǎn)量有16％的提高；在添加10 mM的乙酸鈉、甲基丙二酸、半胱氨酸混合溶液時，epothilone A和B的產(chǎn)量分別提高了68％和270％。由此看見，這些小分子物質(zhì)的添加是與So0157-2的埃博霉素合成能力密切相關(guān)的。其中，我們首次將與epothilone B

16、合成的前體物質(zhì)甲基丙二酸單酰-CoA具有相同碳鏈骨架的甲基丙二酸添加到發(fā)酵培養(yǎng)中，并取得了良好的效果：在添加5 mM的甲基丙二酸時，epothilone B的產(chǎn)量比對照提高了86％。這些結(jié)果為進(jìn)一步利用連續(xù)或半連續(xù)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行前體物質(zhì)添加提供了基礎(chǔ)，同時也為GSUV3-205發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素的產(chǎn)物選擇提供了思路。
　　 GSUV3-205在液體培養(yǎng)基中聚團(tuán)生長的特性成為該菌株大規(guī)模發(fā)酵及產(chǎn)業(yè)化道路上的重要障礙，同時這對于GSUV

17、3-205的某些性質(zhì)研究及遺傳操作方面來說也是一個巨大的難題。我們希望通過生物學(xué)手段對GSUV3-205進(jìn)行性狀改造，在保持埃博霉素產(chǎn)生能力不變的情況下使其能夠在液體培養(yǎng)基中分散生長。這樣一方面可以提高單位培養(yǎng)基中的生物量從而提高埃博霉素的單位產(chǎn)量，加快其工業(yè)化應(yīng)用的進(jìn)程，另一方面，還能夠給我們進(jìn)一步探索GSUV3-205的性質(zhì)及遺傳操作帶來極大的方便。
　　 因此我們從生物馴化和遺傳改造這兩個角度進(jìn)行了獲取GSUV3-205液

18、體分散生長突變株的嘗試。通過特殊設(shè)計的馴化流程對GSUV3-205進(jìn)行了長時間的馴化培養(yǎng)。經(jīng)過8個循環(huán)的馴化培養(yǎng)，我們最終得到了一株在M26液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)有些分散的菌株GSUV3-205XH。盡管通過一系列的驗證及分析發(fā)現(xiàn)，GSUHV3-205XH生長非常緩慢而且?guī)缀鯖]有埃博霉素產(chǎn)生能力，但是今后我們可以結(jié)合genome shuffling的思路方法利用這個菌株與埃博霉素高產(chǎn)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合從而對菌株進(jìn)行育種改良，則有可能會得

19、到具有多重優(yōu)良性狀(分散生長、代時短、合成次級代謝產(chǎn)物能力突出)的突變菌株。
　　 隨后，我們通過分析可能與GSUV3-205聚團(tuán)生長密切相關(guān)的基因，選擇目前還沒有在纖維堆囊菌中進(jìn)行過相關(guān)研究的pilA基因和epsD基因，通過克隆基因的同源片段構(gòu)建了pCCPA和pCCED兩種插入失活重組質(zhì)粒。通過使用添加抗生素的接合轉(zhuǎn)移體系，獲得了70株抗性接合菌株。此后我們對其進(jìn)行液體生長狀態(tài)進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)這些抗性菌株經(jīng)過長期培養(yǎng)并不能夠在液