白氏文昌魚Pax4-6基因的克隆以及功能的初步探究.pdf

1、文昌魚（amphioxus或lancelet）隸屬脊索動物門(Phylum Chordata)頭索動物亞門（Subphylum Cephalochordata），在脊椎動物的演化過程中扮演非常重要的角色。Pax4/6屬于Pax基因家族成員，該家族所編碼的蛋白是一類在后口動物中均十分保守的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 本文對白氏文昌魚（Branchiostoma belcheri）Pax4/6基因進(jìn)行克隆，并確定該基因至少存在3種轉(zhuǎn)錄本(Bb

2、Pax4/6-AP1～3)，其區(qū)別在于5' UTR以及N端的若干個氨基酸序列，形成的原因是選擇性啟動子的使用。在研究3種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式之前，我們首先對BbPax4/6整體表達(dá)情況進(jìn)行研究，通過實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)該基因從神經(jīng)胚早期才開始出現(xiàn)微弱表達(dá)，在神經(jīng)胚中期達(dá)到最高之后其表達(dá)量逐漸下降。原位雜交結(jié)果顯示該基因的表達(dá)區(qū)域特異地出現(xiàn)于胚體最前端、神經(jīng)管前端位點(diǎn)以及口前窩（將來發(fā)育成哈氏窩，與脊椎動物腺垂體同源），推測BbPax4/6可

3、能與嗅覺相關(guān)細(xì)胞、前眼（與脊椎動物對眼同源）以及口前窩的發(fā)育相關(guān)，并且這些功能在文昌魚與脊椎動物中均十分保守。
　　 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，BbPax4/6的3種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量與表達(dá)趨勢上存在差異，但是，整胚原位雜交的結(jié)果初步顯示，3種轉(zhuǎn)錄本均在胚體前端、神經(jīng)板（管）前端位點(diǎn)以及口前窩表達(dá)，并沒有出現(xiàn)表達(dá)區(qū)域的分化。分析原因可能是3種轉(zhuǎn)錄本確實(shí)均在這幾個表達(dá)區(qū)域起作用，同一區(qū)域中，各自的表達(dá)量可能存在著差異，但是通過整胚原位

4、雜交無法體現(xiàn)這些差異。此外，頭索動物文昌魚與脊椎動物有所不同，脊椎動物中許多復(fù)雜的器官（如兩側(cè)對稱的眼），在文昌魚內(nèi)也許只有若干個細(xì)胞與之同源（脊椎動物對眼的同源結(jié)構(gòu)——文昌魚前眼僅由一個前端的色素眼點(diǎn)和與之相應(yīng)的感光細(xì)胞以及一些神經(jīng)細(xì)胞組成），不過這些細(xì)胞之間仍然有分化。同一基因在這些細(xì)胞作用時，可能需要不同轉(zhuǎn)錄本來運(yùn)作，但這些轉(zhuǎn)錄本可能只存在細(xì)胞與細(xì)胞之間的微小差別，這些差別可能無法通過整胚原位雜交來體現(xiàn)。
　　 我們針對B

5、bPax4/6設(shè)計(jì)了1條Morpholino(MO)與4條siRNA，利用顯微注射技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對BbPax4/6基因抑制的研究。其中MO設(shè)計(jì)位置為轉(zhuǎn)錄本BbPax4/6-AP2翻譯起始位點(diǎn)上游-46bp～-22bp區(qū)域。通過對胚胎正常發(fā)育率的統(tǒng)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)注射過MO的實(shí)驗(yàn)組與注射過control MO的對照組之間并不存在顯著性差異，因此我們推測不同轉(zhuǎn)錄本之間可能存在代償機(jī)制，使PAX4/6蛋白水平并未受到影響。此外，在3種轉(zhuǎn)錄本共有的保守