白氏文昌魚RAB1基因的克隆、原核表達(dá)與免疫功能分析.pdf

1、絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可調(diào)控多種生物學(xué)過程。TGF-β激活激酶-1(TAK1)，也稱為絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)，最初是作為MAPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶被發(fā)現(xiàn)的。TAK1通過介導(dǎo)激活核因子κB(NF-κB)、c-Jun氮末端激酶(JNK)和p38通路來應(yīng)對(duì)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和toll樣受體的刺激。TAB1（也就是TAK1結(jié)合蛋白）是蛋白激酶TAK1的

2、一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，并且可以特異性的作用于TAK1氮末端從而直接誘導(dǎo)TAK1激酶活性。文昌魚在進(jìn)化過程中作為無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間的過渡物種，位于脊索動(dòng)物的底端，是研究脊椎動(dòng)物免疫進(jìn)化的重要材料。為了進(jìn)一步的研究TAB1基因的功能和進(jìn)化，本論文首次克隆了白氏文昌魚的TAB1基因，對(duì)該基因序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并且采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了白氏文昌魚TAB1蛋白。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測TAB1基因的時(shí)空表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

3、
　　(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆得到白氏文昌魚TAB1基因全長序列。TAB1基因全長為2281bp，其中ORF序列長度為1659bp，可編碼533個(gè)氨基酸，5'非翻譯區(qū)長度為89bp，3'非翻譯區(qū)長度為533bp。利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了PET32a-TAB1表達(dá)載體，通過原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)，IPTG低溫誘導(dǎo)6h后成功表達(dá)出大小為62KDa的特異性蛋白，進(jìn)一步利用Anti-His tag抗體采用Western bl

4、ot方法初步驗(yàn)證該特異蛋白就是重組表達(dá)的TAB1蛋白。
　　(2)白氏文昌魚TAB1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析表明:文昌魚TAB1蛋白序列與其它物種之間相似性高;文昌魚TAB1基因組由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成;文昌魚TAB1基因序列含有一個(gè)特異的PP2Cc結(jié)構(gòu)域;與另外20個(gè)物種的TAB1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明白氏文昌魚TAB1位于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間且白氏文昌魚TAB1基因?qū)儆赥AB1基因家族。
　　(3)通

5、過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測文昌魚TAB1基因在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索和性腺等6個(gè)不同組織中的表達(dá)量情況，結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在各個(gè)組織中都有表達(dá)，且TAB1基因在性腺中的表達(dá)量最高，在肝盲囊、肌肉和脊索中的表達(dá)量相對(duì)較高，在鰓和腸中的表達(dá)量最低。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測TAB1基因在LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h和48h)的表達(dá)量情況。結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在6h時(shí)的相對(duì)表達(dá)