中國青島文昌魚TNF1和TNFR1的克隆及功能初步研究.pdf

1、文昌魚在進化上特殊的地位，為揭示免疫系統(tǒng)的起源和進化以及低等生物的免疫系統(tǒng)的研究提供了一個很好的模型?，F(xiàn)在對脊椎動物的TNFSF和TNFRSF的起源和進化并不是很清楚。本文通過一系列研究方法對中國青島文昌魚的一個TNF和一個TNFR分子進行了研究。為這兩個家族成員及它們信號通路的起源和進化提供了線索。 本文首次在文昌魚中克隆了一個TNFSF成員——TNF1和一個TNFRSF成員一-TNFR1。搜索佛羅里達文昌魚基因組獲得了一條編

2、碼含有TNF domain分子的序列，據(jù)此設(shè)計特異引物通過PCR獲得了青島文昌魚的TNF1的序列；同時在全魚和消化道cDNA文庫中，獲得了TNFR1的完整的序列。兩者都是跨膜分子，都具有其家族成員的典型特征：TNF1在其C端具有一個TNF domain；而TNFR1在其N端具有4個CRD，在胞內(nèi)具有一個TRAF結(jié)合位點。Southern blot的結(jié)果表明文昌魚的TNF1具有兩個拷貝，而TNFR1則只有一個拷貝。通過real time

3、PCR和原位雜交方法證明兩個基因都在文昌魚主要的免疫器官——消化道中有高表達；在受LPS刺激時，在感染的早期就會有比較高的上調(diào)(分別在刺激6小時和4小時后)。這表明在進化過程中，TNFSF-TNFRSF系統(tǒng)在文昌魚這個時期已經(jīng)參與免疫反應(yīng)。在文昌魚的胚胎發(fā)育階段，兩個基因都具有比較相似的表達模式：在胚胎發(fā)育早期(囊胚期和原腸胚)和幼蟲階段有比較高的表達。 成功地用pET28a 構(gòu)建了文昌魚TNF1的原核表達載體：pET28a-T

4、NF1，并用表達宿主菌B121對文昌魚TNF1進行了比較成功的重組表達。經(jīng)過Ni柱親和層析和陰離子交換層析等方法，獲得較純的可溶的目的蛋白。純化的蛋白注射文昌魚后，并沒有發(fā)現(xiàn)細胞增殖、遷移或者組織病變等現(xiàn)象。 構(gòu)建了文昌魚TNF1和TNFR1的真核表達載體，成功的轉(zhuǎn)染293T細胞并且在其中表達。實驗結(jié)果也證明文昌魚的TNF1是跨膜分子。CoIP實驗表明，文昌魚的TNF1可以和TNFR1相互作用。由于TNFR1的胞內(nèi)區(qū)具有一個TR