從文昌魚(yú)G6Pase基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控探索肝臟起源.pdf

1、文昌魚(yú)屬于頭索動(dòng)物，在無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的進(jìn)程中占據(jù)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，是研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的珍貴模式生物。先前的眾多研究表明，在文昌魚(yú)中存在類(lèi)似于脊椎動(dòng)物肝臟的組織被稱(chēng)為肝盲囊。肝臟是脊椎動(dòng)物特有器官，是維持糖代謝平衡的重要場(chǎng)所。那么文昌魚(yú)肝盲囊是否也具有類(lèi)似的調(diào)節(jié)糖代謝功能呢？這是本文研究的主要問(wèn)題。
　　脊椎動(dòng)物的葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)由三種同工酶組成，即G6Pase-Ⅰ、G6Pase-Ⅱ和G6Pase-Ⅲ。

2、它能催化葡萄糖-6-磷酸水解成為磷酸基和游離的葡萄糖，這個(gè)催化過(guò)程是糖異生和糖原分解的最后一個(gè)關(guān)鍵步驟，因此對(duì)血糖水平的調(diào)節(jié)具有十分重要的作用。目前有大量的研究針對(duì)的是脊椎動(dòng)物中的葡萄糖-6-磷酸酶，但在無(wú)脊椎動(dòng)物當(dāng)中有關(guān)葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)和調(diào)控的研究則十分有限。
　　本文對(duì)文昌魚(yú)（Branchiostoma japonicum）中的葡萄糖-6-磷酸酶進(jìn)行了鑒定，獲得了全長(zhǎng)為2053 bp的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列，其中開(kāi)放閱

3、讀框?yàn)?095 bp，編碼364個(gè)氨基酸。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)此預(yù)測(cè)的蛋白序列與脊椎動(dòng)物的三種G6Pase具有29.8％至39.1％的一致性，與無(wú)脊椎動(dòng)物有20.4％至46.7％的一致性。雖然斑馬魚(yú)的G6Pase與文昌魚(yú)的序列一致性只有33.6％和38.8％，但是它們的3D結(jié)構(gòu)具有驚人的相似性，暗示文昌魚(yú)G6Pase與斑馬魚(yú)G6Pase的功能也具有一定的相似性。有關(guān)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)分析和共線(xiàn)性等分析結(jié)果顯示了文昌魚(yú)G6Pase與脊椎動(dòng)物的G

4、6Pase-Ⅲ具有更密切的關(guān)系。因此，文昌魚(yú)的G6Pase可能與脊椎動(dòng)物G6Pase-Ⅲ類(lèi)似，是G6Pase基因原型代表，而脊椎動(dòng)物的三種G6Pase是在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)過(guò)兩輪基因復(fù)制產(chǎn)生的。
　　我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)檢測(cè)到G6Pase在肝盲囊和卵巢中大量表達(dá)，具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。我們也證明了文昌魚(yú)肝盲囊和斑馬魚(yú)肝臟在經(jīng)過(guò)重組斑馬魚(yú)生長(zhǎng)激素(rzGH)處理之后G6Pase的表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。然后，利用rzGH進(jìn)行長(zhǎng)

5、時(shí)間處理，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，rzGH仍舊具有促進(jìn)作用?？偠灾?，rzGH所引起的G6Pase的表達(dá)模式和趨勢(shì)在文昌魚(yú)肝盲囊和斑馬魚(yú)肝臟中是相似的。
　　通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)文昌魚(yú)肝盲囊提取物和鼠肝臟提取物都能與鼠抗人的G6Pase抗體發(fā)生結(jié)合，在大約40kDa的位置形成一條與我們所預(yù)測(cè)的蛋白大小近似的條帶，這證明了在文昌魚(yú)中存在天然的葡萄糖-6-磷酸酶。然后，我們通過(guò)測(cè)定肝盲囊，腸和去除兩者后的文昌魚(yú)提取物中的G6Pase活性

6、，來(lái)定位該酶主要的表達(dá)部位。結(jié)果顯示肝盲囊中G6Pase的活性要比腸高出1.6倍，而在去除肝盲囊和腸的文昌魚(yú)提取物中其活性極其低。隨后，我們對(duì)文昌魚(yú)進(jìn)行了饑餓和投喂處理，然后剖取肝盲囊進(jìn)行G6Pase活性測(cè)定，與對(duì)照相比，G6Pase的活性在饑餓狀態(tài)下提高了82％，并且在攝食之后降低到原先活性的75％，而文昌魚(yú)肝盲囊中G6Pase活性的這種變化（在投喂之后降低，饑餓處理之后升高）與脊椎動(dòng)物中觀(guān)測(cè)到的結(jié)果一致。
　　總而言之，本文論