文昌魚天然兔疫探索-體液的調(diào)理作用以及溶菌酶基因克隆.pdf

1、補體系統(tǒng)是先天性免疫系統(tǒng)的重要成分，脊椎動物尤其是哺乳動物的補體系統(tǒng)作用機制己經(jīng)比較清晰，而無脊椎動物的補體系統(tǒng)僅在頭索動物文昌魚、尾索動物海鞘、棘皮動物等少數(shù)物種中開展。文昌魚屬于頭索動物，在進化地位上屬于無脊椎動物到脊椎動物的過渡型，故對于補體系統(tǒng)的發(fā)育和進化的研究有著很重要的意義。己有研究表明文昌魚存在補體系統(tǒng)，己經(jīng)克隆得到的補體成分包括C3，Bf，MASP以及C6-like等。在功能上文昌魚體液能夠通過激活補體系統(tǒng)的替代途徑，發(fā)

2、揮溶解紅血球和病原菌的作用。但文昌魚補體功能上是否如脊椎動物補體一樣，具有調(diào)理作用尚不清楚。
　　本文的主要目的即是探究文昌魚補體系統(tǒng)是否具有調(diào)理吞噬作用。文昌魚具有與脊椎動物循環(huán)系統(tǒng)大體相似的循環(huán)系統(tǒng)，但是沒有可以自由循環(huán)的血細胞。所以，本實驗選用了妒魚(Lateolabrax japonicus)巨噬細胞研究文昌魚體液的調(diào)理作用，也就是把與文昌魚體液作用過的酵母細胞和妒魚巨噬細胞混合，共育后統(tǒng)計巨噬細胞的吞噬能力，由此來評價文

3、昌魚體液的調(diào)理作用。首先，酵母經(jīng)文昌魚體液孵育后與妒魚巨噬細胞混合進行吞噬實驗，妒魚的巨噬細胞的吞噬能力顯著提高。這說明文昌魚體液與妒魚巨噬細胞之間存在相互作用，也說明文昌魚體液具有調(diào)理吞噬的作用。文昌魚體液的調(diào)理作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性；文昌魚體液梯度稀釋4倍后，仍然能夠顯著促進妒魚巨噬細胞的吞噬作用。將文昌魚體液加熱45oC處理30min后（夠?qū)⒀a體失活）再處理酵母，進行吞噬實驗，發(fā)現(xiàn)文昌魚體液的調(diào)理作用明顯減弱。這暗示文昌魚體液的

4、這種調(diào)理作用可能與補體系統(tǒng)相關。C3是脊椎動物中補體系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)理作用的主要成分，為了驗證文昌魚補體系統(tǒng)中C3是否參與文昌魚補體調(diào)理作用，利用抗原抗體反應將文昌魚體液中的C3成分沉淀后，進行吞噬實驗。結(jié)果表明用C3抗體處理過的體液，其調(diào)理吞噬作用明顯減弱。同樣，用Bf（替代途徑激活的重要因子）抗體處理文昌魚體液后進行吞噬實驗，文昌魚體液的調(diào)理作用也明顯減弱。這些都說明文昌魚體液的調(diào)理吞噬作用的確與補體有關。另外，用文昌魚體液處理酵母后，

5、從酵母表面洗脫下來的蛋白片段經(jīng)電泳和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)能夠與C3抗體結(jié)合，說明C3的裂解片段能夠結(jié)合到酵母表面，這為文昌魚體液的調(diào)理吞噬作用是通過補體來實現(xiàn)提供了進一步證據(jù)。綜上所述，文昌魚體液可能是通過替代途徑將補體激活，導致C3的裂解片段沉積到酵母表面，通過巨噬細胞上相應的受體的識別發(fā)揮調(diào)理吞噬作用。
　　本研究證明文昌魚補體系統(tǒng)可以和脊椎動物（妒魚）巨噬細胞互作，符合并支持無脊椎動物和脊椎動物補體共同起源假設

6、。溶菌酶是先天性免疫的重要成分，在動物界中存在三種類型：g型溶菌酶，c型溶菌酶和i型溶菌酶。文昌魚是目前唯一兼具三種類型溶菌酶的物種，對研究溶菌酶的發(fā)生和進化有極其重要的意義。從文昌魚中克隆了全長為1014bp的g型溶菌酶(AmpLyz-g)，其開放閱讀框為801 bp，編碼266個氨基酸。該蛋白序列經(jīng)Signal P3.0server預測，發(fā)現(xiàn)其氨基端有15個氨基酸組成的信號肽。經(jīng)Smart預測其結(jié)構(gòu)域，文昌魚AmpLyz-g含有g(shù)型

7、溶菌酶共有的結(jié)構(gòu)域STL（如圖3-11）及三個可能的的催化位點（E153，E187以及D178）。AmpLyz-g與魚類的g型溶菌酶蛋白序列的一致性很高，可達到50％以上，與哺乳動物一致性則相對較低，僅30％左右。文昌魚的g型溶菌酶蛋白序列由七個外顯子編碼，前三個外顯子不包含任何結(jié)構(gòu)域，后四個外顯子與脊椎動物的四個外顯子一一對應，且內(nèi)含子插入類型也完全一致。從文昌魚中克隆到了兩個i型溶菌酶(AmpLyz-i) cDNA全長，較長i型溶菌

8、酶的為全長1053 bp的，較短的cDNA全長849 bp，其開放閱讀框為501bp，編碼167個氨基酸，且這兩個序列開放閱讀框序列一致。該蛋白包括一個i型溶菌酶的保守結(jié)構(gòu)域destabilase及三個保守的催化位點（Glu36，Asp49以及Asn120）。AmpLyz-i與同為后口動物的棘皮動物i型溶菌酶序列的一致性很高，可達到60％左右。文昌魚Lyz-i與節(jié)肢動物一致性比較低，不到30％。系統(tǒng)進化分析表明，三類溶菌酶各自聚為一簇，