基因重組酒香酵母菌株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的高密度液態(tài)發(fā)酵模型及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是組成纖維素酶系必不可少的成分。本研究對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株B.anomalus PSY-001分別進(jìn)行紫外誘變和超聲波誘變，從誘變菌株中篩選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的兩親株U1和V1，進(jìn)行三次種內(nèi)基因重組，以β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo)，篩選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的新融合菌株F3-25，對(duì)F3-25的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并建立該菌株的高密度液態(tài)發(fā)酵模型，采用AKTA purifi

2、er-900蛋白分離純化工作站對(duì)該菌株生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化并進(jìn)行酶性質(zhì)分析，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的依據(jù)。
　　 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1，以B.anomalus PSY-001為出發(fā)菌株，分別進(jìn)行紫外誘變和超聲波誘變，從誘變菌株中篩選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株進(jìn)行三次種內(nèi)基因重組。通過初篩培養(yǎng)基篩選后，再以β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo)，篩選出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的新融合菌株F3-25。融合菌株F3-25

3、產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活比原始菌株提高了近8倍。
　　 2，運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到融合菌株F3-25的最佳培養(yǎng)基組成：當(dāng)麩皮濃度為53.15 g/L，酵母粉濃度為3.03g/L，KCl濃度為0.204g/L，CaCl2濃度為0.611g/L時(shí)，β-葡萄糖苷酶的酶活最高，為4.794U/mL。
　　 通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了融合菌株F3-25的最佳搖瓶發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為30℃、25

4、0mL錐形瓶裝液量為20mL、搖床轉(zhuǎn)數(shù)為150r/min、接種量為3%、初始pH值為5。
　　 3，對(duì)F3-25的補(bǔ)料分批發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。運(yùn)用Orign8.0軟件擬合得到融合菌株F3-25在該條件下的生長動(dòng)力學(xué)模型為：Cx(t)=0.05*e0.244t/{1-(0.05/3.01)(1-e0.244t)}。
　　 4，利用AKTA purifier-900蛋白分離純化工作站，采用葡聚糖凝膠G-100層析，使β-葡萄

5、糖苷酶的純化率達(dá)到了96.2%，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)為電泳純，得到兩條帶，測(cè)定其兩個(gè)亞基的分子量分別為50.3KDa和67.8KDa，運(yùn)用電泳分析軟件BandScan4.3對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，得到其亞基的含量分別為40.5%和57.3%。
　　 融合菌株F3-25發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，最適反應(yīng)溫度為60℃，在40℃～50℃溫度條件下，具有較好的熱穩(wěn)定性；最適pH值為5.0，在pH為5.0～6.0范圍內(nèi)，具有較好的穩(wěn)定性