新型工業(yè)絮凝酵母的構(gòu)建與乙醇耐性研究.pdf

1、絮凝是工業(yè)釀酒酵母的重要特征，利用絮凝分離菌體，替代離心分離，可顯著降低菌體分離成本，但國內(nèi)外研究較多的組成型絮凝對生長有抑制作用，如果使用誘導型絮凝菌株，在發(fā)酵前期保持游離狀態(tài)，而發(fā)酵結(jié)束后開始絮凝沉降，既能保證細胞通過自沉降采收，又可減輕組成型絮凝帶來的內(nèi)擴散效應。此外，選育脅迫耐受性提高的工業(yè)釀酒酵母菌株，可以使其在高濃度乙醇等脅迫條件下具有良好的活性，從而提高發(fā)酵終點的乙醇濃度，節(jié)省下游過程如乙醇精餾和廢糟液處理等的能耗。本論文

2、的主要研究目的是構(gòu)建新型誘導絮凝的工業(yè)釀酒酵母，并尋找關(guān)鍵的乙醇耐性相關(guān)基因，為選育高效乙醇發(fā)酵工業(yè)酵母奠定基礎。
　　酵母的絮凝表型可以通過表達絮凝基因來獲得。本文克隆了來源于自絮凝酵母SPSC01的絮凝基因FLO1，并將其整合到工業(yè)釀酒酵母菌株Sc4126染色體上，通過SPSC01中克隆的海藻糖6-磷酸合酶TPS1啟動子調(diào)控其表達，從而構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的誘導型絮凝酵母，其絮凝性狀可以響應乙醇濃度變化，在發(fā)酵前期乙醇濃度較低時絮凝

3、較弱，因此保證酵母細胞能良好生長，在發(fā)酵后期乙醇濃度高時絮凝增強，從而實現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后酵母自沉降采收。所構(gòu)建的誘導型絮凝酵母的乙醇發(fā)酵性能與組成型絮凝酵母相比顯著改善，其生長和發(fā)酵接近游離酵母宿主。進一步通過模式菌株S288c來源的TPS1啟動子對絮凝性狀實現(xiàn)精細調(diào)控，由于模式酵母S288c的TPS1啟動子脅迫響應原件STRE個數(shù)比SPSC01中克隆的TPS1啟動子少，所構(gòu)建的絮凝酵母對乙醇的響應得以弱化，延遲了絮凝的發(fā)生并降低了絮凝強度

4、，從而進一步提高了發(fā)酵效率，而且在發(fā)酵終點酵母可以完全沉降實現(xiàn)菌體與產(chǎn)物的自動分離。
　　酵母細胞的乙醇耐受性由多基因調(diào)控，改造轉(zhuǎn)錄因子是提高酵母細胞乙醇耐受性的有效策略。前期研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加鋅離子可以顯著提高酵母細胞的乙醇耐性。因此進一步深入研究了鋅離子提高酵母細胞乙醇耐性的機理，從而尋找關(guān)鍵的代謝調(diào)控基因進行耐性菌株的構(gòu)建。利用150 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基進行乙醇連續(xù)發(fā)酵，在培養(yǎng)基中添加0.05 g/L的硫酸鋅后，酵母細

5、胞的乙醇耐受性提高，乙酸和丙酮酸等副產(chǎn)物及胞內(nèi)活性氧水平下降，絮凝性也下降，但細胞的氮和麥角固醇含量提高。轉(zhuǎn)錄組與蛋白組分析共檢測到330個轉(zhuǎn)錄表達差異基因和71個蛋白表達差異基因，表明鋅離子可能通過調(diào)節(jié)細胞全局基因表達水平對代謝產(chǎn)生影響。轉(zhuǎn)錄組分析和蛋白組分析結(jié)果不完全一致，說明存在大量轉(zhuǎn)錄與翻譯水平不一致的情況，推測鋅對細胞代謝的調(diào)控存在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平的修飾。受鋅離子調(diào)控的主要代謝通路包括核糖體合成、糖酵解與乙醇生成、磷脂與麥角固

6、醇合成、ROS響應及相關(guān)的氧化還原系統(tǒng)、細胞絮凝、胞內(nèi)鋅離子平衡及轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制等?？梢钥紤]選取這些途徑中的相關(guān)酶和差異表達的轉(zhuǎn)錄因子作為后續(xù)乙醇耐性改造的靶點。還發(fā)現(xiàn)了94個功能未知的基因響應鋅離子的添加，為進一步探討鋅離子提高酵母菌乙醇耐性的機理，并對關(guān)鍵的調(diào)控基因進行代謝工程改造奠定了基礎。最后利用人工鋅指蛋白技術(shù)進行了基因組工程改造，證明人工轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)可以有效選育乙醇耐性提高的工業(yè)釀酒酵母。本論文的研究為進一步選育高效乙醇