高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的分析、食品級誘導(dǎo)表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（L-Arabinose Isomerase,L-AI）是生物法異構(gòu)化D-半乳糖為D-塔格糖的關(guān)鍵酶。本研究從腌菜和泡菜中分離出一批乳酸菌，經(jīng)紙色譜法初篩和改良半胱氨酸咔唑法復(fù)篩，獲得1株粗酶酶活達(dá)13.95U/mL的高產(chǎn)D-塔格糖的乳酸菌，通過NCBI進行16S rDNA序列比對及生化特征分析，鑒定其為植物乳桿菌并命名為WU14。上傳這株菌株部分16S rDNA基因序列至NCBI基因庫，獲得Genbank序列登入號：

2、KJ918744。
　　根據(jù)菌種特異性及基因保守性設(shè)計L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因引物，通過PCR擴增得到這株菌株的 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，對這株菌株的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因進行TA克隆并上傳該段基因序列至Genbank。此外，通過對Lactobacillus plantarum WU14的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因進行生物信息學(xué)研究及其粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究來深入了解植物乳桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶蛋白結(jié)構(gòu)及其特異性。結(jié)果顯示：Lactoba

3、cillus plantarum WU14 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的構(gòu)成是以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主且不具有信號肽也不具有跨膜結(jié)構(gòu)的一類胞內(nèi)酶。該酶在最佳溫度60℃，最佳pH7.17，最適底物濃度為0.8mol/L反應(yīng)28h時，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到56.12％。L.plantarum WU14的L-AI基因獲得Genbank序列登入號：KJ778785。
　　以不改變L-AI的氨基酸一級結(jié)構(gòu)為前提，通過設(shè)計L.plantarum WU14的L

4、-AI基因的特異性內(nèi)外引物，運用重組PCR技術(shù)去除L-AI基因中的NcoⅠ酶切位點，再將重組L-AI基因插入含有NcoⅠ和HindⅢ酶切位點的食品級表達(dá)載體pRNA48中得到重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入Lactococcus lactis NZ9000感受態(tài)細(xì)胞中，獲得了L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI。
　　利用nisin對L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI進行誘導(dǎo)，提取胞內(nèi)蛋白后后采用聚丙烯酰胺凝

5、膠電泳（sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和改良的半胱氨酸咔唑法分析目的蛋白的表達(dá)情況及粗酶酶活。結(jié)果顯示：當(dāng)菌液中nisin誘導(dǎo)濃度達(dá)到30ng/mL，誘導(dǎo)12h后，目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，60℃下，粗酶酶活達(dá)到6.21U/mL。與此同時，以重懸的菌液和超聲波破碎得到的粗酶液進行酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在溫度為50℃，pH7.17左右，D-半乳糖濃度為0.6mol