利用分子學方法研究生鮮乳中細菌的多樣性.pdf

1、牛乳及乳制品具有極高的營養(yǎng)價值，在人們?nèi)粘５纳攀辰Y(jié)構(gòu)中占有重要的地位和作用。同時，它也為各類細菌的生長滋生提供了良好的介質(zhì)。生鮮乳的品質(zhì)好壞是影響乳制品質(zhì)量安全的關(guān)鍵，必須從根源上控制生鮮乳的質(zhì)量。因此，有必要建立一種快速有效的檢測方法對生鮮乳中微生物的種類及群落結(jié)構(gòu)進行分析。
　　本研究選擇山東和寧夏的生鮮乳(即剛擠出的未經(jīng)處理的生鮮牛奶)作為研究對象，采用傳統(tǒng)分離純化、生理生化特性的分析、可培養(yǎng)菌株DNA的提取-PCR擴增16

2、S rDNA基因片段-分子測序獲取生鮮乳中菌群的16S rRNA基因全序列信息，應用微生物學方法和分子生物學方法相結(jié)合的方式對山東和寧夏生鮮乳中細菌的種類、菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行分析。對16S rDNA序列分析結(jié)果表明：山東A、B、C三處在6月份的生鮮乳奶樣中34株可培養(yǎng)菌株鑒定出來的細菌種屬主要有不動桿菌屬Acinetobacter sp.占細菌總數(shù)的26.5％和克雷伯氏菌屬Klebsiella sp.占細菌總數(shù)的14.7%。寧夏D

3、、E、F三處在10月份的生鮮乳奶樣中21株可培養(yǎng)菌株鑒定出來的細菌種屬主要有乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactis subsp.lactis和不動桿菌屬Acinetobacter sp.分別占細菌總量的33.3%和14.3%。山東A處在10月份的生鮮乳樣中9株可培養(yǎng)菌鑒定出的細菌種類主要是綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa占細菌總數(shù)的22.2%。
　　由于大部分的細菌不能通過培養(yǎng)的方式被鑒定出

4、來的，因此通過純培養(yǎng)的方式不能真正反映生鮮乳中細菌的種類多樣性。由于生鮮乳中的菌量較少，直接提取宏基因組DNA較困難，因而本研究先將生鮮乳中的菌體快速過濾富集后，再提取宏基因組DNA，以細菌的通用引物27F和1492R擴增16S rDNA片段，將PCR擴增產(chǎn)物與T-載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α，菌落 PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并用限制性內(nèi)切酶MspI和HaeⅢ對陽性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR擴增產(chǎn)物16S rDNA片段進行酶

5、切，獲得酶切指紋圖譜，利用ARDRA多態(tài)性分析聚類，去除兩種酶切產(chǎn)物都相同的菌株，挑選出代表性菌株并進行16S rDNA測序，獲得生鮮乳中細菌的16S rDNA文庫，對16S rDNA序列分析結(jié)果表明：山東10月份生鮮乳樣A克隆文庫中主要乳酸菌Lactic acid bacterium占克隆總數(shù)的25%。寧夏克隆文庫主要為乳球菌屬Lactococcus sp.占克隆總數(shù)的62.5%。
　　由于利用16S rDNA-ARDRA建立克