布拉氏酵母菌基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是1920年從印尼水果中分離得到的一種非致病性酵母菌，作為益生菌被歐洲、非洲和南非等國(guó)家廣泛的應(yīng)用于治療和預(yù)防腹瀉和腸道失調(diào)。布拉氏酵母菌被認(rèn)為是最有價(jià)值的益生菌之一。傳統(tǒng)意義上，益生菌作為食物添加劑來改善腸道微生物平衡，還可以用來治療感染性胃腸炎和治療過程中抗生素引起的并發(fā)癥性腹瀉。對(duì)布拉氏酵母菌益生性的研究成為熱點(diǎn)。然而，多數(shù)研究著眼于生產(chǎn)和臨床應(yīng)用，關(guān)于布拉氏酵母菌益生

2、機(jī)制特別是分子方面的研究卻很少。其主要的原因是，沒有適合布拉氏酵母菌的分子遺傳工具。包括關(guān)鍵基因的敲除、調(diào)控表達(dá)、表面展示等。研究表明，布拉菌是釀酒酵母(S.cerevisiae)的變異株。盡管很多研究證明布拉氏酵母菌是釀酒酵母的一個(gè)分支，但是卻有一些完全不同于釀酒酵母的生物學(xué)、生理學(xué)、代謝及遺傳學(xué)特性，例如，布拉氏酵母菌不能利用半乳糖，對(duì)低pH和溫度有很高的耐受性，并且在氮源缺乏時(shí)可以形成假菌絲，特別是布拉氏酵母菌是雙倍體而且不能孢子

3、化。許多適用于釀酒酵母的分子遺傳工具不能直接用于布拉氏酵母菌。想要研究布拉氏酵母菌益生機(jī)制，需要構(gòu)建適合的分子遺傳工具。
　　本研究旨在建立一套有效的適用于布拉氏酵母菌的基因敲除體系，主要以成熟應(yīng)用于釀酒酵母及其他真菌中的用同源重組的技術(shù)和Cre-loxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以URA3基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行敲除系統(tǒng)的構(gòu)建，篩選出合適的篩選標(biāo)記，將原始質(zhì)粒pZC1改造成帶有多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒pSBGD。然后通過PCR的方法和克隆的方法構(gòu)建兩側(cè)帶有

4、短（長(zhǎng)）同源臂的loxP-marker-loxP基因敲除組件，選擇適合布拉氏酵母菌的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的基因敲除組件轉(zhuǎn)染到酵母基因組中，同時(shí)利用帶有cre基因的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記的重復(fù)利用，通過篩選標(biāo)記的篩選并經(jīng)過PCR鑒定得到突變株。URA3基因缺失的突變株表現(xiàn)為不能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而將URA3基因重新導(dǎo)入到突變株中后可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
　　該系統(tǒng)可以通過PCR方法和克隆方法進(jìn)行基因敲除，還可以將敲除

5、的基因重新導(dǎo)入到突變株中，除了在目的基因處殘留34個(gè)堿基外，外源基因都可以從菌體內(nèi)刪除。
　　布拉氏酵母菌基因敲除系統(tǒng)的成功構(gòu)建，為從分子水平上研究布拉氏酵母菌的作用機(jī)理、基因調(diào)控通路和機(jī)理提供了強(qiáng)有力的手段。通過進(jìn)行功能基因的敲除、插入及染色體基因的交換，進(jìn)而阻斷微生物細(xì)胞的代謝旁路、減弱毒/副作用、強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)或通過細(xì)胞壁成分的分析進(jìn)行抗真菌藥物研制。
　　本研究將構(gòu)建的系統(tǒng)應(yīng)用于布拉氏酵母菌MC