基于電場驅動的上轉發(fā)光免疫層析快速檢測技術研究.pdf

1、目的：
　　免疫層析檢測技術是一種經(jīng)典的即時檢測（point-of-care testing，POCT）技術，目前已廣泛應用于疾病診斷、食品安全檢驗、生物反恐偵檢等多個領域。近年來，隨著現(xiàn)代科學的不斷進步，生物醫(yī)藥與納米材料、光電子等不同學科的交叉融合產(chǎn)生和發(fā)展了一系列高新生物技術，同時也為免疫層析技術的深入發(fā)展提供了新的契機與動力。本研究將外部電場引入到上轉發(fā)光免疫層析檢測技術體系中，擬以電場作為層析驅動力來進一步提升免疫層析的

2、檢測速度和檢測性能，從而建立一種新型的電場驅動式免疫層析快速檢測技術，即電致免疫層析技術，簡稱電致層析。
　　方法：
　　[1]電致層析理論體系與技術平臺的建立：首先，構建免疫層析有關層析運動的物理模型，從理論上闡釋外加電場對層析動力的影響及作用規(guī)律，從而建立電致層析檢測技術的層析動力學理論體系。其次，基于上轉發(fā)光免疫層析技術平臺進行電致層析實驗技術平臺的搭建，并通過實驗來觀測外加電場對免疫層析試紙檢測信號的影響，進行電致層

3、析理論模型的實驗驗證。
　　[2]電致層析動力學研究及生物效應評價：以鼠疫耶爾森氏菌（簡稱鼠疫菌）檢測試紙為實驗對象，鼠疫菌為檢測靶標，實時觀測不同電場方向和電場強度對試紙檢測信號以及檢測速度的影響，從而闡釋外加電場對層析動力的作用規(guī)律；同時，詳細研究不同強度外加電場對鼠疫菌檢測敏感性的影響，并對其可能影響機制進行探討，依此進行電致層析檢測敏感性的優(yōu)化研究。
　　[3]電致層析技術在病原菌快速檢測中的應用：以鼠疫菌為檢測靶標

4、，以上轉發(fā)光免疫層析方法（無電場）為對照，系統(tǒng)評價電致層析在鼠疫菌快速檢測中的綜合性能，包括檢測敏感性、定量線性和精密性；采用假結核耶爾森氏菌、小腸耶爾森氏菌以及炭疽芽孢桿菌等種屬近緣或特定情況下可能同時存在的菌株進行電致層析檢測特異性評價；在鼠疫菌液中加入一定濃度的酸、堿、鹽、粘性物質以及生物基質（生物大分子）等不同類型的干擾物，評價電致層析對復雜樣品的檢測耐受性。
　　結果：
　　[1]電致層析理論體系與技術平臺的建立：

5、以試紙中信號源顆粒濃度為模型參數(shù)，基于相場模型構建了電致層析的理論模型；以方程的形式從理論上分析了外加電場對層析動力的影響，解析了電場在顆粒濃度分布、流量分布和流速分布中的動力作用。另外，我們基于上轉發(fā)光免疫層析技術平臺搭建了電致層析技術平臺，實現(xiàn)了對電場作用下的試紙檢測信號的實時監(jiān)測；結果顯示，試紙檢測信號的強度增長率隨著正向（電場方向與層析流動方向一致為正向，反之為反向）電場強度的增加而增加，并且實驗測試值與基于理論模型的預測值具有

6、較高的一致性。
　　[2]電致層析動力學研究及生物效應評價：在試紙上施加不同方向的電場并對檢測信號進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)正向電場在15V強度下即可顯著提高試紙的檢測信號強度，而反向電場則對檢測信號具有明顯的抑制作用。進一步分析不同強度（15~60V）正向電場作用下的試紙檢測信號強度及層析速度：（1）隨著電場強度的增加，試紙檢測信號強度也逐漸增加，但是到60V時信號開始回落；（2）層析速度（信號平臺）隨著電場強度的增加而逐漸加快，檢測信號進

7、入平臺期的時間可由15min縮短至5min。結果表明外加電場可以有效地促進作為信號源的上轉發(fā)光納米顆粒從試紙結合墊中的解離，并且加快顆粒的層析速度。電致層析生物效應評價實驗結果顯示，施加電場（20~50V）可使免疫層析反應時間縮短至5min，且檢測敏感性隨著電場強度增加而增加。
　　[3]電致層析技術在病原菌快速檢測中的應用：電致上轉發(fā)光免疫層析可將檢測時間縮短至5min，且檢測敏感性、定量范圍、精密性、特異性、樣品耐受性等綜合性

8、能并未因此受到影響。就鼠疫菌檢測而言，最低檢測限可達5.0×102CFU/mL，與上轉發(fā)光免疫層析（未加電）檢測法敏感性相當；可對5.0×102CFU/mL~5.0×106CFU/mL濃度范圍內的鼠疫菌進行準確定量（R2=0.9978），并且檢測結果具有較高的精密性（CV≤10％）；與假結核耶爾森氏菌、小腸耶爾森氏菌以及炭疽芽孢桿菌等九種種屬近緣菌株或或特定情況下可能同時存在的菌株均未見交叉反應；在較高濃度的HCl（pH≥3）、NaOH

9、（pH≤12）、NaCl（≤0.5M）、PEG20000（≤5%）、BSA（≤200mg/mL）等干擾物質存在于檢測樣品中時，電致層析檢測體系均表現(xiàn)出較強的耐受性，鼠疫菌最低檢測限仍可達到5.0×102CFU/mL~5.0×103CFU/mL。
　　結論：
　　本研究基于上轉發(fā)光免疫層析技術平臺，建立了一種電場驅動的新型免疫層析快速檢測技術，即電致層析。我們首先構建了電致層析的物理模型，從理論上分析了外加電場在層析動力中的作

10、用，并對理論模型進行了實驗驗證?；谑笠呔鷻z測試紙，我們從實驗方面詳細分析了不同電場條件對層析動力的影響及作用規(guī)律：電致層析可以有效促進信號源顆粒從試紙結合墊的解離，并提高顆粒的層析速率，從而可以明顯加快層析反應的進程，縮短檢測所需時間。以鼠疫菌為檢測靶標，結果顯示，電致層析在將上轉發(fā)光免疫層析檢測用時由15min顯著縮短至5min的同時，仍然可以保持優(yōu)越的檢測敏感性、特異性以及定量準確性等性能；并且，電致層析同樣展現(xiàn)出較強的樣本耐受性