伯克氏菌E264連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)ThailandepsinA的研究.pdf

1、伯克氏菌E264（Burkholderia thailandensisE264）是從泰國(guó)稻田中分離得到的，能夠合成組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）類抗癌物質(zhì)Thailandepsin A。作為抗癌藥物FK228的結(jié)構(gòu)類似物，Thailandepsin A與FK228有不同的選擇性抑制特點(diǎn)，尤其對(duì)皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤具顯著抑制作用。盡管Thailandepsin A作為抗癌藥物極具開(kāi)發(fā)前景，但如何大量獲取Thailandepsin A成

2、為相關(guān)研究的瓶頸。目前，野生型菌株合成Thailandepsin A產(chǎn)量很低（10mg/L），在對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后有一定提高。本論文在此基礎(chǔ)上，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高Thailandepsin A的產(chǎn)量，同時(shí)將發(fā)酵過(guò)程放大至5L發(fā)酵罐，通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附耦合裝置與發(fā)酵過(guò)程偶聯(lián)，解除產(chǎn)物抑制，實(shí)現(xiàn)連續(xù)吸附耦合發(fā)酵，從而提高Thailandepsin A的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。
　　首先，通過(guò)搖瓶發(fā)酵方法，用單因素試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探索適合

3、伯克氏菌E264菌株產(chǎn)Thailandepsin A的培養(yǎng)基成分，重點(diǎn)就不同種類和濃度的氨基酸前體、復(fù)合碳氮源、微量元素對(duì)Thailandepsin A產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究，得出結(jié)論：最適濃度的α-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸和甘氨酸復(fù)合添加至培養(yǎng)基中，Thailandepsin A的產(chǎn)量較對(duì)照提高65.9％；葡萄糖和甘油復(fù)合作為碳源能顯著提高伯克氏菌 E264生產(chǎn)Thailandepsin A的產(chǎn)量，最高能較對(duì)照提高54.48%（

4、配比100%/20%）；胰蛋白胨和硫酸銨或氯化銨作為復(fù)合氮源，則不利于Thailandepsin A的高產(chǎn)；添加以下微量元素能提高Thailandepsin A產(chǎn)量：FeSO4·7H2O（最適添加濃度1mg/L）/FeCl3（最適添加濃度1mg/L）、ZnSO4·7H2O（最適添加濃度2mg/L）、、MnCl2·4H2O（最適添加濃度0.1mg/L）。
　　其次，初步探索了在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)糖對(duì)Thailandepsin A產(chǎn)量的影響

5、，通過(guò)設(shè)計(jì)累進(jìn)補(bǔ)糖策略，使Thailandepsin A的產(chǎn)量最高達(dá)到205.29mg/L，是未補(bǔ)糖對(duì)照組的2.28倍，是最初培養(yǎng)基產(chǎn)量的20.5倍。從而找出其最適補(bǔ)糖分批發(fā)酵的條件，為后續(xù)的放大優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
　　再次，將伯克氏菌E264發(fā)酵生產(chǎn)Thailandepsin A的過(guò)程放大到5L發(fā)酵罐，通過(guò)摸索通氣條件、樹(shù)脂吸附、種源條件等條件，探索Thailandepsin A放大發(fā)酵的最優(yōu)條件。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和制作了外置式吸

6、附耦合裝置，使之與發(fā)酵罐形成吸附與發(fā)酵耦合的過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)伯克氏菌E264的連續(xù)發(fā)酵，同時(shí)配合不同的循環(huán)流速、開(kāi)啟時(shí)間、補(bǔ)糖策略的研究，以提高Thailandepsin A的產(chǎn)量。
　　通過(guò)優(yōu)化，伯克氏菌E264吸附耦合放大發(fā)酵生產(chǎn)Thailandepsin A的最優(yōu)生產(chǎn)條件確定為：（1）接種量1%，種源為三級(jí)發(fā)酵種子；（2）攪拌轉(zhuǎn)速：150rpm；通氣量：1.3L/min；（3）罐壓0.01MPa，發(fā)酵溫度28℃；（4）耦合吸附

7、裝置，裝置中內(nèi)添加4%預(yù)處理后樹(shù)脂，裝置在發(fā)酵36h后開(kāi)始不間歇運(yùn)轉(zhuǎn)，循環(huán)流速20ml/min；（5）從60h起，每12h流加1g/L的葡萄糖，直至發(fā)酵結(jié)束；（6）發(fā)酵終點(diǎn)采用經(jīng)驗(yàn)方法，也即菌體不再生長(zhǎng)后的24h停止。經(jīng)驗(yàn)證，Thailandepsin A的產(chǎn)量能夠達(dá)到224.11mg/L，是發(fā)酵罐優(yōu)化前的5.6倍，是最初培養(yǎng)基產(chǎn)量的22.4倍。生產(chǎn)效率達(dá)到1.10 mg/L*h-1，與發(fā)酵罐優(yōu)化前相比大幅提高了65%，是最初培養(yǎng)基生產(chǎn)