CD40Ig聯(lián)合青藤堿對(duì)異種鼠腎移植排斥反應(yīng)中Bcl-2-Bax表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)將PLNCX2-HA-CD40Ig基因包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒局部轉(zhuǎn)染入豚鼠腎臟，通過(guò)阻斷CD40-CD40L共刺激通路，誘導(dǎo)免疫耐受，同時(shí)應(yīng)用免疫抑制劑青藤堿，抑制受鼠外周血CD4+細(xì)胞增殖，觀察兩者聯(lián)合作用對(duì)豚鼠到SD大鼠異種腎移植中排斥反應(yīng)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響，從而為異種腎移植抗排斥反應(yīng)提供新的方法與策略。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用12-14周齡的雄性SD大鼠、雄性豚鼠各40只，實(shí)驗(yàn)

2、隨機(jī)分為4組（每組SD大鼠、豚鼠各十只）。A組:空載體逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)染+生理鹽水組；B組:空載體逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)染+青藤堿組；C組:CD40Ig逆轉(zhuǎn)錄病毒基因局部轉(zhuǎn)染組；D組:CD40Ig逆轉(zhuǎn)錄病毒基因局部轉(zhuǎn)染+青藤堿組。手術(shù)方式為以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將CD40Ig局部轉(zhuǎn)染到豚鼠雙腎，將雙腎整塊移植到SD大鼠頸部左腎用做移植腎，右腎用做Westen bloting檢測(cè)右腎CD40Ig轉(zhuǎn)染率。觀察各組受鼠術(shù)后移植腎存活時(shí)間、受鼠存活時(shí)間。

3、術(shù)后48小時(shí)受鼠尾靜脈采血查血肌酐值同時(shí)檢測(cè)48小時(shí)尿量；采用Westen bloting和免疫組化技術(shù)檢測(cè)移植腎Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)。采用HE染色觀察術(shù)后各組大鼠移植腎排斥反應(yīng)級(jí)別。
　　結(jié)果：
　　1.血肌酐值及尿量測(cè)定
　　術(shù)后48h受鼠尾靜脈抽血檢測(cè)肌酐值：B、C組肌酐值分別為（9.20±0.83）mg/L、（9.20±0.73）mg/L，明顯低于A組（15.00±1.00） mg/L（P<0.05），

4、而D組肌酐值最低，為(4.10±0.81)mg/L，與其他3組相比差異有顯著性（P<0.05）。
　　術(shù)后48h尿量值：B、C組分別為（11.80±1.09）ml、（11.50±1.12） ml，明顯高于A組（6.40±0.55）ml（P<0.05），而D組尿量最多，為（18.90±0.85）ml，與其他3組相比差異有顯著性（P<0.05）。
　　2.移植腎及受鼠存活時(shí)間
　　A組受鼠移植腎存活時(shí)間為（5.60±0.8

5、9）d，受鼠的存活時(shí)間為(6.50±0.87)d；B組、C組移植腎存活時(shí)間分別為(10.45±0.85)d、（10.90±0.83）d;受鼠存活時(shí)間分別為(12.40±0.86)d、（12.90±0.83)d，均長(zhǎng)于A組（P<0.05)，其中D組移植腎及受鼠存活時(shí)間最長(zhǎng)，分別為（14.60±0.83）d及（17.50±0.83）d。D組與其他3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　3、Western blotting<

6、br>　　供腎移植到受鼠頸部后，Western blotting檢測(cè)到各實(shí)驗(yàn)組被切取右腎CD40Ig的不同表達(dá)，其中C、D組可檢測(cè)到CD40Ig的表達(dá)，A、B組未見(jiàn)CD40Ig表達(dá)。術(shù)后各組移植腎均可見(jiàn)Bax蛋白的表達(dá)。A組表達(dá)最強(qiáng)，B、C組表達(dá)較A組減弱，而B組與C組差別不顯著（P>0.05），D組明顯弱于其他3組（P<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組移植腎均可見(jiàn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，A組表達(dá)微弱，B組、C組Bcl-2蛋白表達(dá)均較A組強(qiáng)，但二者差

7、別不顯著（P>0.05），D組表達(dá)明顯強(qiáng)于其他3組（P<0.05）。
　　4. HE染色
　　各實(shí)驗(yàn)組移植腎標(biāo)本行HE染色檢查，采用Banff09移植腎病理分級(jí)結(jié)果示：A組病理分級(jí)為IIB-III級(jí)，移植腎組織可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表示移植腎排斥反應(yīng)強(qiáng)烈。B、C組病理分級(jí)為IIA-III級(jí)，移植腎組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度低于A組。D組病理分級(jí)為IA-IIB級(jí)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯低于A、B、C三組。
　　5.免疫組織化學(xué)檢

8、測(cè)
　　免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組移植腎Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)情況：
　　A組移植腎組織都呈棕褐色，Bax為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性率100％；B組、C組移植腎組織強(qiáng)陽(yáng)性率分別為60％和40％；D組有1例呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，4例呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，強(qiáng)陽(yáng)性率20％。
　　A組移植腎組織Bcl-2表達(dá)都呈弱陽(yáng)性反應(yīng)；B組、C組移植腎組織強(qiáng)陽(yáng)性率分別為40％和60％；D組移植腎組織Bcl-2表達(dá)4例呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，1例呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，強(qiáng)陽(yáng)性率8

9、0％。
　　結(jié)論：
　　1、CD40Ig具有抗排斥作用，使Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，延長(zhǎng)移植腎存活時(shí)間。
　　2、青藤堿具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，能抑制異種鼠腎移植排斥反應(yīng)，使Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，延長(zhǎng)移植腎存活時(shí)間。
　　3、CD40Ig與青藤堿具有協(xié)同抗排斥作用，同時(shí)應(yīng)用CD40Ig和青藤堿能顯著減輕異種鼠腎移植排斥反應(yīng)，使 Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著增強(qiáng)，明顯延長(zhǎng)移植腎存活