海藻中類金屬硫蛋白-多肽的檢測(cè)分析及對(duì)金屬誘導(dǎo)響應(yīng)研究.pdf

1、長期以來，海洋環(huán)境中重金屬污染及防治問題越來越受人們的關(guān)注，然而，海洋環(huán)境中重金屬的含量高低、分布模式、遷移轉(zhuǎn)化及其與影響化學(xué)因素間的作用等科學(xué)問題是國內(nèi)外科研者關(guān)心的焦點(diǎn)，并且如何有效的治理海洋環(huán)境中重金屬也成為當(dāng)今十分急迫的研究工作之一。目前，利用大型海藻進(jìn)行海洋水體中重金屬治理是一種低投資、高效益的技術(shù)，且對(duì)攝入體內(nèi)的重金屬與巰基蛋白結(jié)合后有一定的解毒功能。藻體中類金屬硫蛋白(MTL)及多肽化合物是一類金屬離子誘導(dǎo)下產(chǎn)生的富含半胱

2、氨酸的低分子量蛋白，具有很強(qiáng)的重金屬結(jié)合能力，對(duì)重金屬的解毒及代謝等方面具有重要作用。本文為了研究藻體內(nèi)類金屬硫蛋白及多肽與重金屬的相互作用及生物效應(yīng)研究，探索海藻因金屬誘導(dǎo)后體內(nèi)蛋白與多肽的變化而導(dǎo)致其對(duì)重金屬富集能力及耐毒性的改變，為進(jìn)一步探索以海藻中肽、蛋白為標(biāo)志物來指示海洋環(huán)境中重金屬污染狀況，發(fā)揮海藻在海洋環(huán)境中重金屬的修復(fù)作用潛力提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，本論文開展了以下主要研究工作:
　　首先，建立微波快速消解前處理技

3、術(shù)，以及電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定藻體中微量元素的定量方法，方法準(zhǔn)確度較高，線性較好，相關(guān)性系數(shù)均為0.999以上。另外分析了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重金屬培養(yǎng)和威海養(yǎng)殖區(qū)培育的多種海帶中重金屬含量，結(jié)果顯示:海帶對(duì)Cu、Zn和Cd元素呈現(xiàn)不同程度富集能力，并隨著時(shí)間和濃度的變化較明顯;奔牛、平板菜、三海、生產(chǎn)種、榮福、江蘺和龍須菜不同種海帶對(duì)同一重金屬的富集含量存在差異，且各品種海帶對(duì)不同重金屬的富集相對(duì)含量差異性較大。
　　第二，建立了藻體中類

4、金屬硫蛋白提取及純化技術(shù)，利用葡聚糖凝膠柱能夠分離純化類金屬硫蛋白;借助蛋白結(jié)合金屬信號(hào)實(shí)現(xiàn)了低濃度蛋白的組分在線收集;通過凝聚電泳法對(duì)類金屬硫蛋白分子量范圍初步確認(rèn)，分子范圍在6.5kDa～7.0kDa間，利用高靈敏度質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)了類金屬硫蛋白分子量準(zhǔn)確測(cè)定，獲得所收集到的類金屬硫蛋白分子為6.570kDa。通過優(yōu)化色譜條件，建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)機(jī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了雙重檢測(cè)對(duì)類金屬硫蛋白的定量分析，探索了蛋白紫外吸收信號(hào)

5、與結(jié)合金屬相關(guān)性，結(jié)果顯示，基于金屬元素信號(hào)能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白低濃度定量分析，并且金屬蛋白與金屬離子結(jié)合比較穩(wěn)定。
　　第三，運(yùn)用化學(xué)滲透法從海藻中的提取谷胱甘肽(GSH)化合物，利用熒光試劑鄰苯二甲醛與GSH反應(yīng)生成的具有熒光衍生物，建立一種簡便、快速測(cè)定藻體中GSH含量的方法，該方法方便快捷，準(zhǔn)確度較好?？疾炝薈d2+脅迫培養(yǎng)海帶對(duì)的富集能力及GSH變化趨勢(shì)，并研究了金屬Cd濃度與GSH變化相關(guān)性，結(jié)果表明藻體中谷胱甘肽與Cd呈現(xiàn)正

6、相關(guān)性，藻體內(nèi)谷胱甘肽的含量隨誘導(dǎo)濃度的增加有遞增趨勢(shì)，但變化幅度相對(duì)較小。
　　第四，以谷胱甘肽(GSH)為底物的酶促反應(yīng)合成多肽化合物，其具有金屬可誘導(dǎo)性，研究中建立了單熒光試劑（單溴二胺）標(biāo)記多肽化合物的方法，標(biāo)記衍生物穩(wěn)定性較好，1周內(nèi)其熒光信號(hào)幾乎不變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5％，利用質(zhì)譜法測(cè)定標(biāo)記前后多肽化合物分子量，確定最終單溴二胺和多肽間的標(biāo)記比例為1∶1，同時(shí)率先建立了GSH和PC2-PC6六種化合物同時(shí)定量分析方

7、法，6種化合物在14min-23min間實(shí)現(xiàn)完整分離，通過檢測(cè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果顯示線性較好，各化合物檢出限較低;同時(shí)測(cè)定了不同品種海帶中多肽化合物的含量，藻體中多肽濃度含量達(dá)到mg/g級(jí)，為進(jìn)一步研究多肽對(duì)重金屬誘導(dǎo)響應(yīng)奠定方法基礎(chǔ)。
　　第五，相同條件下，利用單一重金屬脅迫培養(yǎng)誘導(dǎo)海帶，比較類金屬硫蛋白及多肽的本底值，研究不同重金屬誘導(dǎo)類金屬硫蛋白及多肽的表達(dá)趨勢(shì)與差異性，結(jié)果顯示，海帶內(nèi)類金屬硫蛋白在Cu和Cd的單元素誘導(dǎo)下呈