小球藻鋅結(jié)合類金屬硫蛋白的提取及其功能研究.pdf

1、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類分子量小、巰基含量高的蛋白質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體平衡等功能。目前商品化的MT大多從兔肝提取，其技術(shù)難度大、生產(chǎn)成本高，故開發(fā)MT的原材料資源具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞含有類金屬硫蛋白，且通過重金屬脅迫可顯著提高其含量?；诖耍菊撐耐ㄟ^Zn2+脅迫小球藻誘導(dǎo)產(chǎn)生類金屬硫蛋白，經(jīng)分離、純化得到小球藻類金屬硫蛋白，并且對其抑制酪氨酸酶、抗紫外輻射和抗鎘損傷的功能進(jìn)行試驗。

2、
　　本研究分為五個部分：第一章，介紹了金屬硫蛋白的來源、結(jié)構(gòu)、生理功能、檢測方法與應(yīng)用領(lǐng)域，并對微藻類金屬硫蛋白的提取、結(jié)構(gòu)表征和應(yīng)用進(jìn)行綜述。第二章，通過不同濃度（5、10、20、50、100μmol/L）Zn2+脅迫培養(yǎng)小球藻，考察Zn2+脅迫下小球藻細(xì)胞的生理學(xué)響應(yīng)機(jī)制。發(fā)現(xiàn) Zn2+脅迫將降低小球藻細(xì)胞的葉綠素含量，影響其抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT、POD）的活性，并促進(jìn)其脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而抑制小球藻細(xì)胞的生長

3、。但Zn2+同時也具有促進(jìn)小球藻Zn-MT-like蛋白生物合成的作用，當(dāng)用50μmol/L Zn2+脅迫培養(yǎng)72 h，可使小球藻Zn-MT-like蛋白含量提高2.5倍以上。此外，通過差速離心法考察Zn在小球藻細(xì)胞的亞細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)鋅主要分布于熱穩(wěn)定蛋白（HSF）組分中，且其含量隨 Zn2+脅迫濃度的提高而增加，說明小球藻可通過HSF組分結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鋅，從而起到降低其損傷細(xì)胞的作用。第三章，小球藻經(jīng)50μmol/L Zn2+脅迫培

4、養(yǎng)72 h，離心收集藻細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞破碎、離心后，提取小球藻蛋白質(zhì)溶液。蛋白溶液分別經(jīng)葡聚糖凝膠G-75、G-25層析柱分離、純化后，經(jīng)冷凍干燥得到小球藻Zn-MT-like蛋白制品，每克鮮藻可提取20mg的小球藻類金屬硫蛋白。經(jīng)試驗，發(fā)現(xiàn)該小球藻 Zn-MT-like蛋白純度為91.8％，且其分子量與MT相近。第四章，研究小球藻類金屬硫蛋白對酪氨酸酶的抑制作用。發(fā)現(xiàn)小球藻Zn-MT-like蛋白具有延長單酚酶遲滯時間，并具有抑制單酚酶穩(wěn)

5、定態(tài)酶和二酚酶活性的作用，10 mg/mL的小球藻Zn-MT-like蛋白可延長單酚酶遲滯時間至2300 s、幾乎能完全抑制單酚酶穩(wěn)定態(tài)酶的活性，且對二酚酶活性的抑制率高達(dá)87%。第五章，建立NIH/3T3細(xì)胞紫外輻射和鎘損傷的模型，考察小球藻Zn-MT-like蛋白抗紫外輻射和抗鎘損傷的作用。結(jié)果表明：小球藻Zn-MT-like蛋白具有較強(qiáng)的抗紫外輻射作用，10 mg/mL的小球藻Zn-MT-like蛋白可減少NIH/3T3細(xì)胞空泡、