中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中Enterolysin及Helveticin J基因多樣性及抑菌活性研究.pdf

1、隨著食品工業(yè)及食品國際貿(mào)易的日益擴大,國內(nèi)外對食品安全問題也越來越重視,如何防止食品腐敗變質(zhì)顯得極為重要,而目前市面上的防腐劑大多都是化學防腐劑,如果食用過量會對人體造成一定的損害,因此,像細菌素這類無毒無害的生物防腐劑的開發(fā)應(yīng)用顯得極具潛力。
　　乳酸菌細菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)。在低濃度下就能對有害菌產(chǎn)生不可逆地殺滅作用。它們可被人體生物降解和消化,對健康無害。大部分乳酸菌細菌素僅對親緣關(guān)系較近的菌株

2、產(chǎn)生抑制作用,只有少數(shù)具有較廣的抑菌譜。迄今為止,乳酸菌細菌素大致被分為三類:I類細菌素是羊毛硫抗生素,是小的肽類,翻譯后修飾;II類細菌素是未經(jīng)修飾的,熱穩(wěn)定的肽類;III類乳酸菌細菌素是目前乳酸菌細菌素中研究較少的一類,這一類細菌素屬于大分子的,熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類細菌素。目前,僅有五種III類的乳酸菌細菌素被描述過:Millericin, Enterolysin A(EnlA), Zoocin A, Lysostaphin and

3、Helveticin J(HlvJ)分別由Streptococcus milleri, Enterococcus faecalis, Streptococcuszooepidemicus4881, Staphylococcus aureus, and Lactobacillus helveticus產(chǎn)生,本研究主要研究的是Enterolysin A(EnlA)和Helveticin J(HlvJ)。Lactobacillus helve

4、ticus481產(chǎn)生的Helveticin J是染色體編碼的細菌素,具有較窄的抑菌譜,分子量37511Da,熱不穩(wěn)定,作用機制是殺菌;Enterolysin A是由Enterococcus faecalis LMG2333產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定的蛋白,具有較廣的抑菌譜,通過破壞敏感菌株的細胞壁來殺死細菌,根據(jù)已知文獻報道,Enterolysin可以抑制乳桿菌、腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌屬等等,極具研究潛力。
　　

5、中國有很多手工制作的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,一些發(fā)酵食品中富含豐富的微生物菌群,因此,這些發(fā)酵食品中的微生物菌群可以為細菌素基因挖掘提供良好的平臺,然而,迄今為止,這方面的研究還很少。在這次研究中,通過使用不依賴培養(yǎng)的宏基因組技術(shù)來研究六種中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的Enterolysin及Helveticin J的多樣性,并通過抑菌表達實驗來研究它們的抑菌活性。
　　在本研究中,通過使用不依賴于培養(yǎng)的宏基因組方法對六種中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的Ente

6、rolysin和Helveticin J基因多樣性進行研究,在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已知的Enterolysin和Helveticin J氨基酸序列,用clustal W對其進行氨基酸序列比對,找到保守區(qū)域,用CODEHOP進行引物設(shè)計,通過PCR的方法在六種發(fā)酵食品樣品中擴增Enterolysin和Helveticin J基因,PCR產(chǎn)物純化后連接到pGM-T載體上構(gòu)建成克隆文庫并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。實驗結(jié)果顯示,在4個克隆文庫中

7、　　(DFE,RSE,GCE,QCE)擴增到Enterolysin基因(77-80aa),這些基因與NCBI中已知的氨基酸序列84％-96%相似,在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在同一個分支中;在5個克隆文庫中擴增到Helveticin J基因(169-196aa),這些基因與NCBI中已知的氨基酸序列58%-100%相似?；谝呀?jīng)獲得的Enterolysin和Helveticin J基因部分片段,選擇2條Enterolysin基因序列和2條Helv

8、eticin J基因序列用基因步移的方法進行全長基因擴增。獲得基因全長后,連接到pET-28a表達載體中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。EnlA(DFE5)蛋白質(zhì)分子量大小30.6kDa,經(jīng)抑菌活性檢測,能夠抑制3種指示菌,其中包括致病性的單增李斯特氏菌屬和金黃色葡萄球菌屬。HlvJ(RS9)編碼249個氨基酸,經(jīng)抑菌活性檢測,僅對瑞士乳桿菌有抑菌作用;EnlA(GCE11)蛋白質(zhì)分子量大小25.3kDa,經(jīng)抑菌活性檢測后發(fā)