巴斯德桿菌透明質(zhì)酸合酶底物適應(yīng)性分析及HA寡糖和TFA衍生物一鍋多酶法的合成.pdf

1、糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）是一類帶有負(fù)電荷的長(zhǎng)鏈大分子多糖，它由重復(fù)的二糖單元結(jié)構(gòu)組成，其中的雙糖單位是N-位乙酰化或硫酸化的己糖胺與一個(gè)糖醛酸以共價(jià)鍵連接起來(lái)的結(jié)構(gòu)。根據(jù)雙糖單位的不同，糖胺聚糖包括透明質(zhì)酸(hyaluronic Acid，HA)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)等。其中，HA的重復(fù)二糖單元是β1,4連接的葡

2、糖醛酸(glucuronic acid，GlcUA)和β1,3連接的N-位乙酰化的葡糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）。HA以蛋白聚糖的形式廣泛存在于動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，其在細(xì)胞的發(fā)育、修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，還是一些角膜、軟骨、肌腱、皮膚、結(jié)締組織等機(jī)體系統(tǒng)的重要組成成分。由于HA分子良好的親水性和黏彈性，其在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎、眼科疾病及其他一些疾病的治療，另外也廣泛應(yīng)用于化妝品及保健品中。
　

3、　來(lái)源于革蘭氏陰性A型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida Type A）的HA聚合酶(pmHAS)屬于二型(ClassⅡ)聚合酶，含有972個(gè)氨基酸殘基，具有相對(duì)獨(dú)立的兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域。pmHAS1-703是可溶性的蛋白，分別以GlcNAc和GlcUA核苷酸活化的單糖作為供體，依次催化兩種單糖連接合成到糖鏈?zhǔn)荏w的非還原端，不斷地延長(zhǎng)糖鏈。
　　pmHAS以及幾種糖核苷酸合成酶的一鍋多酶體系可以利用相對(duì)便宜

4、的底物來(lái)合成HA寡糖以及其TFA修飾的HA衍生物，節(jié)約了成本，簡(jiǎn)化了反應(yīng)過(guò)程以及純化步驟。其中TFA修飾的HA衍生物用來(lái)進(jìn)行硫酸化HA生成的研究，進(jìn)而用來(lái)驗(yàn)證HA硫酸化衍生物是否具有抑制人源HA酶的活性而有效延長(zhǎng)注射HA在體內(nèi)的作用時(shí)間。
　　本論文研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建了Pasteurella multocida Type A的HA聚合酶(pmHAS)的重組表達(dá)系統(tǒng);確定了pmHAS誘導(dǎo)表達(dá)及純化的條件。

5、r>　　(2)初步分析了重組pmHAS的單糖供體及受體的底物適應(yīng)性:除HA骨架外，與HA具有相同糖苷鍵連接形式的CS寡糖也可以作為pmHAS的合成受體;而HS骨架寡糖由于其糖苷鍵連接形式與HA差異較大，不能作為該酶的底物。
　　(3)構(gòu)建了Arabidopsis thaliana的葡萄醛酸激酶(AtGlcAK)重組表達(dá)系統(tǒng)，確定AtGlcAK的表達(dá)純化條件，與UDP-sugar焦磷酸化酶(USP)合用體外酶法合成糖供體UDP-Gl