三種有機酸對單增李斯特菌誘導性耐酸響應研究.pdf

1、單增李斯特菌是危害公共衛(wèi)生安全的首要致病菌，能引起人、畜共患的李斯特菌病，人體感染后表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多，其致死率高達28％。肉類企業(yè)經(jīng)常采用有機酸對其進行防控，之所以采用有機酸是因為其溫和性、有效性及易實用性等優(yōu)點能夠滿足當前消費者對于食品天然、新鮮、少加工及少添加劑等現(xiàn)代消費需求。有機酸通常以噴淋液的形式用于肉表面的清洗減菌如乳酸和醋酸等，或者以添加劑的形式直接添加于肉制品中來抑菌如乳酸鹽和醋酸鹽等，乙酰丙酸也因其具有

2、同樣的抑菌效果而引入使用。但是，研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在弱酸中生長一段時間后能夠增強其后續(xù)的耐酸力，即誘導性耐酸力，這一弱酸誘導細菌產(chǎn)生的耐酸性能夠同時增強細菌穿越胃液的能力并提高毒力，最終會導致高危菌株的出現(xiàn)，對消費者的健康安全造成很大威脅，因此對有機酸使用的安全性進行評估，對于保證肉制品安全和消費者安全健康具有十分重要的意義。之前的研究很少涉及到單增李斯特菌在即食肉制品及預制肉制品的弱酸性環(huán)境中生長后的后續(xù)耐酸性，也很少從有機酸酸根離

3、子的角度對有機酸的誘導耐酸性進行研究。本研究以鹽酸誘導條件為對照組，設定了pH6.0下，4.75mM的L-乳酸、乙酰丙酸及醋酸三種有機酸處理組，檢測酸誘導后四株單增李斯特菌的后續(xù)耐鹽酸/膽酸力，同時從細胞膜組分變化和細胞胞內(nèi)代謝物的相對變化兩方面進行相關機制的探討。主要研究結果和結論如下:
　　1.四株單增李斯特菌的基本生長狀況:每一株單增李斯特菌在pH6.0的弱酸中的生長狀類似，同一株細菌在相同時間進入對數(shù)期和穩(wěn)定期，最大菌落數(shù)

4、為8.9-9.2 lg CFU/mL;菌株間的生長狀況有差異，菌株C1-056生長速率較大，比其他三株菌提前兩個小時進入穩(wěn)定生長期。選取了第4小時和第11小時（C1-056-第9小時）的細菌作為后續(xù)酸激的菌體樣本。
　　2.四株單增李斯特菌的基本耐鹽酸和耐膽酸情況:處于穩(wěn)定生長期的細菌的耐鹽酸及耐膽酸鹽的能力高于對數(shù)生長期。穩(wěn)定期的細菌各菌株之間的耐鹽酸及耐膽酸性差異不十分明顯，對數(shù)期各菌株之間的耐酸性差異顯著。血清型4b的耐酸性

5、要高于血清型1/2a的細菌。細菌的耐膽酸性存在很大的個體差異，與血清型無明顯相關性。
　　3.三種有機酸對單增李斯特菌的誘導性耐酸響應:pH6.0的弱酸環(huán)境均誘導四株細菌產(chǎn)生了增強的后續(xù)耐鹽酸能力，與鹽酸對照組相比，三種有機酸誘導后均提高了細菌的后續(xù)耐酸性，各有機酸對單增李斯特菌誘導力的大小順序依次為:醋酸＞乙酰丙酸＞L-乳酸。鹽酸誘導后細菌的后續(xù)耐膽酸力減弱，但是有機酸的加入使各菌株的耐膽酸性增強。表明單增李斯特菌被有機酸誘導后

6、其耐鹽酸和耐膽酸能力的提高，不僅與pH梯度（氫離子的存在）有關，而且與有機酸酸根離子的存在有關。
　　4.四株單增李斯特菌細胞膜脂肪酸的基本組成及酸誘導后細胞膜組分的改變:四株細菌在最適生長條件下生長至對數(shù)生長期時細胞膜均含有11種脂肪酸(C14～C18)，包括6種支鏈脂肪酸，3種飽和直鏈脂肪酸及2種不飽和直鏈脂肪酸。其中前異脂肪酸的含量較高，多數(shù)菌株中各脂肪酸的含量順序為ai-15＞ai-17＞i-15＞i-17，且前兩種脂肪酸

7、的比例之和大于50％。
　　酸誘導后細菌的細胞膜脂肪酸圖譜發(fā)生改變，多數(shù)菌株的前異脂肪酸C15∶0及直鏈脂肪酸C16∶0含量有所降低，而異脂肪酸C15∶0，C16∶0，C17∶0及前異脂肪酸C17∶0含量均有所升高。C15/C17和anteiso/iso脂肪酸的比值顯著降低，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值并未發(fā)生顯著變化，表明酸誘導后單增李斯特菌細胞膜的碳鏈長度增長，支鏈度降低但是飽和度未發(fā)生變化，也從一定程度上說明弱酸誘導后細菌

8、的細胞膜流動性有所降低。但是有機酸處理組的細菌細胞膜中各脂肪酸含量（C15/C17除外）與鹽酸對照組相比沒有顯著差異，表明氫離子的存在(pH梯度)是促使單增李斯特菌細胞膜脂肪酸圖譜的變化的主導因素，與酸根離子的存在關系不大。結合有機酸誘導后細菌的耐酸響應結果，發(fā)現(xiàn)酸誘導后細胞膜脂肪酸圖譜發(fā)生改變是有機酸對單增李斯特菌誘導性耐酸響應的原因之一，且這一過程酸根離子的貢獻不大。
　　相關分析后發(fā)現(xiàn)，有機酸對單增李斯特菌的誘導性耐酸力與細

9、胞膜脂肪酸C15∶ C17比例的比值呈顯著的負相關關系，比值越高，耐酸力越弱，進一步表明細胞膜脂肪酸的改變（碳鏈長度降低）是有機酸對單增李斯特菌產(chǎn)生誘導性耐酸響應重要原因之一。
　　5.四株單增李斯特菌細胞內(nèi)代謝組分的基本組成及酸誘導后細胞內(nèi)代謝組分的改變:四株單增李斯特菌中共檢測出54種代謝物，包括8種有機酸，9種碳水化合物及磷酸鹽，21種氨基酸及16種以脂肪酸類物質(zhì)為主的代謝物。含量較高的是氨基酸類，其次為脂肪酸類物質(zhì)，糖類物

10、質(zhì)和有機酸類物質(zhì)，甘油為所有代謝物中含量最高的成分。
　　酸誘導后四株細菌中均發(fā)生變化的物質(zhì)為2,4-二羥基丁酸，且所有酸處理組該物質(zhì)的含量均低于空白對照組。果糖的含量在三株細菌(R2-499，C1-056及N1-227)中發(fā)生變化，且酸誘導組中的含量均顯著低于對照組;葡萄糖在菌株R2-499和N1-227中的含量也發(fā)生顯著變化，誘導組含量也顯著低于對照組。但是上述物質(zhì)的含量在有機酸處理組和鹽酸對照組間沒有顯著差異，表明氫離子的存

11、在（pH梯度）是促使單增李斯特菌細胞內(nèi)2,4-二羥基丁酸，果糖及葡萄糖含量發(fā)生變化的主導因素，與酸根離子的存在關系不大。結合有機酸誘導后細菌的耐酸響應結果，發(fā)現(xiàn)酸誘導后細胞內(nèi)2,4-二羥基丁酸，果糖及葡萄糖含量的改變是有機酸對單增李斯特菌誘導性耐酸響應的原因之一，且這一過程酸根離子的貢獻也不大。
　　天冬酰胺的含量在鹽酸誘導后的菌株N1-227和N3-013中含量增加，但是有機酸的加入使其含量降低，這與有機酸對單增李斯特誘導后的耐