單增李斯特菌及溶血素O與葡萄球菌三種腸毒素免疫膠體金檢測技術(shù)研究.pdf

1、本文首先根據(jù)NCBI檢索李斯特菌溶血素O(hly)序列(登錄號(hào)：[gi：134116121])，設(shè)計(jì)引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增，并將其產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆測序質(zhì)粒pMD18-T-hly，進(jìn)行序列分析鑒定。結(jié)果表明，PCR合成的hly基因序列與檢索到的向hly基因序列完全一致。然后用BamH I和Xhol I分別雙酶切pMDl 8-T-hly，載體和表達(dá)載體pET-32al(+)，并連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)

2、-hly。經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)工程菌。利用溫度誘導(dǎo)，在30V誘導(dǎo)培養(yǎng)3.5h后，該工程菌的SDS-PAGE分析顯示，有一條相對(duì)分子質(zhì)量約為60kDa的表達(dá)蛋白區(qū)帶，與預(yù)期的LLO蛋白的大小相符。經(jīng)TotalLab2.0圖像軟件分析，重組LLO蛋白(rLLO)以包涵體形式存在，表達(dá)量約占全菌蛋白的65.48％。 根據(jù)重組蛋白C端帶有6×His標(biāo)簽的特征，用螯

3、合鎳離子．次氨基三乙酸(Ni-NTA)的親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行一步純化。在變性條件下LLO經(jīng)pH梯度洗脫，目的蛋白出現(xiàn)在pH 4.5洗脫液中，其純度達(dá)96.21％，經(jīng)親和純化方法可獲得約2mg/ml的rLLO蛋白。 將單增李斯特菌和純化后的rLLO蛋白、葡萄球菌腸毒素免疫新西蘭大白兔分別制備抗單增李斯特菌和抗rLLO、SE的多克隆抗體，獲得的免疫血清經(jīng)正辛酸-硫酸銨分步沉淀法和蛋白A親和層析純化，其純度約達(dá)98％，定量抗體濃度

4、約為4mg/mL，間接ELISA法檢測抗體效價(jià)為1：10<'8>以上，WB結(jié)果表明所制備的抗原具有很好的免疫原性。純化后的抗單增李斯特菌、抗SE和抗rLLO多抗，利用膠體金免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法研制了膠體金檢測試紙條，用于檢測單增李斯特菌、SE和LLO，并對(duì)該方法進(jìn)行特異性、敏感性、穩(wěn)定性等評(píng)價(jià)。該檢測方法能在5～10min內(nèi)完成樣品檢測，多種不同的菌、蛋白及近緣毒素檢測評(píng)價(jià)顯示該法特異性良好，檢測靈敏性高，SE在奶粉、血清、牛

5、奶、火腿腸等環(huán)境樣品的檢測敏感性也相同。其中單增李斯特菌的敏感性達(dá)到10<'6>CFU/mL，LLO的敏感性能達(dá)到150ng/mL，SEA的敏感性能達(dá)到10ng/mL，SEB的敏感性能達(dá)到1ng/mL，SEC的敏感性能達(dá)到10ng/mL；37℃15天加速試驗(yàn)表明所研制的五種試紙條的穩(wěn)定性良好，保存期在一年以上。本研究建立的膠體金檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，可進(jìn)一步應(yīng)用到檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)進(jìn)出口食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢測實(shí)際工