不同毒力單增李斯特菌LIPI-1全序列分析及致病性差異研究.pdf

1、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種重要的食源性病原菌，自1926年Murray等從家兔體內(nèi)首次分離到本病原后，現(xiàn)已呈世界性分布。2002年被WHO列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。能引起人和動物腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和單核細胞增多等癥狀，發(fā)病率雖低，但死亡率高達30％～70％。不同來源的菌株致病性差異較大，有些菌株致病性很強，而另一些菌株毒力較弱甚至無致病性。

2、
　　 為分析Lm重要毒力因子的遺傳進化關(guān)系，并且進一步探討不同毒力菌株重要毒力因子的分子差異。分段擴增、克隆N21、Lmo0586和N13這三株不同毒力及不同血清型的菌株的第1毒力島(LIPI-1)全基因序列，對三株菌LIPI-1的6個毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB)分別測序并進行序列、分子特征及遺傳變異分析。研究結(jié)果表明，各毒力基因同源性各異，6個毒力基因反映出的進化關(guān)系不一致。弱毒株與其他

3、兩株菌相比，調(diào)控序列prfA只有一個堿基發(fā)生突變，為同義突變，推導(dǎo)氨基酸同源性為100％;弱毒株與其他兩株菌相比hly序列中的PEST基序有一個氨基酸發(fā)生了變化;mpl的穩(wěn)定編碼區(qū)有一個氨基酸發(fā)生變化;三株菌的actA序列差異最顯著，三株菌在ActA蛋白N端介導(dǎo)肌動蛋白活化的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)都存在氨基酸變化，最顯著的差異是Lmo0586和N13與弱毒株N21相比，缺失了105個核苷酸，造成35個氨基酸的缺失，該序列位于ActA蛋白的脯氨酸重復(fù)

4、區(qū)內(nèi);對序列推導(dǎo)的蛋白進行信號肽分析，LIPI-1除prfA基因推導(dǎo)的氨基酸，其他五段基因推導(dǎo)的氨基酸都存在信號肽，且三株菌信號肽切割位置無差異;分析序列推導(dǎo)蛋白的跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)只有actA基因推導(dǎo)的氨基酸序列可能存在跨膜區(qū)域，其中Lmo0586株與N13株的actA基因跨膜區(qū)域位置相同，都在其氨基酸序列的527-594位之間;而N21的跨膜區(qū)序列為607-629間。但是如果除去N21株actA序列中間多重復(fù)表達的氨基酸序列，N21株ac

5、tA序列的跨膜區(qū)位置與其他兩株也是相同的。
　　 為研究不同毒力Lm對機體的致病性差異，選取三株菌種毒力差異顯著的Lmo0586以及N21，在研究兩株菌的溶血活性及溶脂活性的基礎(chǔ)上，通過建立不同毒力的相同菌株及相同毒力的不同菌株的小鼠感染模型（A組低劑量攻弱毒、B組半數(shù)致死量攻弱毒、C組半數(shù)致死量攻強毒、D組過量攻強毒），研究細菌對小鼠的致病性及小鼠對細菌的免疫差異:監(jiān)測Lm在小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布情況;觀察感染小鼠組織病理學(xué)變化;

6、應(yīng)用TUNEL技術(shù)檢測小鼠肝細胞凋亡情況;利用構(gòu)建的小鼠肝臟重要凋亡因子的熒光定量PCR方法，測定小鼠肝臟線粒體凋亡途徑重要因子bax、bcl-2以及死亡受體途徑重要因子caspase8、caspase3、NF-κB的表達量變化;此外對小鼠血清中重要炎性細胞因子IL-12、TNF-α、INF-γ進行動態(tài)觀察。實驗結(jié)果顯示，弱毒株N21與強毒株Lmo0586相比，具有相似的溶血活性以及更強的溶脂活性;不同毒力Lm在小鼠體內(nèi)的遷移能力不同，

7、感染后2h，C組和D組就已經(jīng)在心臟檢出細菌，感染后4h，A組小鼠和B組小鼠還各有一只小鼠未檢出細菌，至感染后6h，D組的一只受檢小鼠就已經(jīng)可以在腦中檢出細菌，感染后8h，A組B組各有一只受檢小鼠可以在腦中檢出細菌，而感染2d后D組還有一只受檢小鼠朱在腦中檢出細菌;感染細菌后，四組小鼠都可見不同程度的肝損傷和腦損傷，損傷程度與細菌毒力呈正相關(guān)，說明不同毒力的細菌對機體損傷強度存在差異;TUNEL檢測的結(jié)果顯示，四組小鼠存在不同程度的肝細胞

8、凋亡;六段序列的標準曲線相關(guān)系數(shù)(r2)都在0.99-1之間，計算的擴增效率都在0.8-1.2之間，說明Q-PCR體系穩(wěn)定，結(jié)果可信度高，可以利用雙標準曲線法對相對表達量進行分析;四組小鼠的caspase8表達量具有相似的變化趨勢，差異不顯著(p＞0.05)，D組比其他三組更快達到峰值，A組小鼠的表達量要略低于其他三組，差異不顯著(p＞0.05);四組小鼠的caspase3與caspase8有相似的變化趨勢，四組小鼠的NF-κB變化趨勢

9、稍緩，且與前兩種凋亡因子趨勢相反，四組小鼠的bax，bcl-2組間和組內(nèi)的變化趨勢都不是很明顯(p＞0.05)，說明Lm引起的肝細胞凋亡依賴死亡受體途徑，且Lm并不引起嚴重的線粒體凋亡;Elisa結(jié)果顯示A、B、C三組小鼠的IL-12組間有相似的變化趨勢(p＞0.05)，大約在8h達到表達的峰值，D組小鼠在4h就已經(jīng)達到峰值;四組小鼠的TNF-α組間具有相似的變化趨勢(p＞0.05)，都在8h的時候出現(xiàn)峰值;四組小鼠的INF-γ組間差異