蟾皮抑制卵巢癌有效成分的篩選及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究分為以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖有效成分的篩選;2.酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用研究;4.酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及影響順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的機(jī)制研究。
　　第一章 蟾皮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖有效成分的的篩選
　　方法:
　　5種蟾皮活性成

2、分酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍噻嚀配置濃度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)，用In cell2000 analyzer統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞存活率。篩選出抑制作用較強(qiáng)的2種成分，進(jìn)一步作用于人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞72小時(shí)，計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:
　　5種蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它靈有較好的抑制卵巢癌S

3、KOV3細(xì)胞活性作用，在濃度高于20μM時(shí)，有明顯的量-效關(guān)系;72小時(shí)測(cè)定并計(jì)算酯蟾毒配基IC50=48.62μM，蟾毒它靈IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒靈、華蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻嚀抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性作用較弱。酯蟾毒配基和蟾毒它靈在濃度高于20μM時(shí)，對(duì)人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞抑制率均高于50％，能明顯抑制人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配

4、基和蟾毒它靈有較好的抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞增殖，為5種蟾皮有效成分中抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性的優(yōu)勢(shì)成分。
　　第二章 酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響
　　方法:
　　酯蟾毒配基配置濃度梯度20、100、500μM單獨(dú)或與順鉑5μM聯(lián)合作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞24、48、72小時(shí)，用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)和Hoechs

5、t熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1、各濃度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用，隨著酯蟾毒配基濃度增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
　　2、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后，相對(duì)于空白對(duì)照組，酯蟾毒配基組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡細(xì)胞(UL)比例均明顯增加，并且這種變化呈現(xiàn)出了劑量依賴性

6、。
　　3、酯蟾毒配基給藥處理后，隨著酯蟾毒配基濃度（20μM、100μM、500μM）的增加，凋亡小體增多。
　　4、在不同濃度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM順鉑聯(lián)合作用72小時(shí)后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性發(fā)生不同的變化趨勢(shì)。20μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM組(P＜0.001)，高于順鉑組(P＜0.05);100μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活

7、性低于酯蟾毒配基100μM組(P＜0.001)，低于順鉑組(P＜0.01);500μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活性與酯蟾毒配基500μM組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，低于順鉑組(P＜0.001)。
　　5、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基聯(lián)合順鉑作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后，相對(duì)于順鉑組，酯蟾毒配基20μM與順鉑聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)比例明顯減少，晚期凋亡(UR)比例變化不明顯。酯蟾毒配基100μM與順鉑

8、聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)變化不明顯，晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM與順鉑聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明顯增加。
　　6、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基聯(lián)合順鉑作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后，Hoechst熒光染色法檢測(cè)到的凋亡變化情況同流式檢測(cè)結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　酯蟾毒配基能明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，具有明顯的濃度、時(shí)間依賴性。并能促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)

9、胞的凋亡。
　　酯蟾毒配基20μM聯(lián)用順鉑，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性的效果不及單用順鉑;酯蟾毒配基100μM聯(lián)用順鉑，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性效果優(yōu)于單用順鉑和單用酯蟾毒配基。不同濃度的酯蟾毒配基和順鉑聯(lián)用后，對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用可產(chǎn)生增強(qiáng)或減弱的影響。
　　第三章 酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用研究
　　方法:
　　卵巢癌細(xì)胞SKOV3注射于裸鼠皮下進(jìn)行移植瘤造模，造模成功

10、后隨機(jī)分為8組，分別給予低、中、高濃度酯蟾毒配基，低、中、高濃度酯蟾毒配基與順鉑合用進(jìn)行干預(yù)，設(shè)置空白對(duì)照組和順鉑組，腹腔注射給藥，酯蟾毒配基隔日1次，順鉑每周1次，比較各組裸鼠移植瘤體積、瘤重。
　　結(jié)果:
　　各組給藥后裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高劑量組各組間抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率由低到高依次為酯蟾毒配基低劑量組(L)＜酯蟾毒配基中劑量組(M)＜酯蟾毒配基高劑量組(H)，順

11、鉑組(PT)、酯蟾毒配基低、中、高劑量和順鉑合用組四組間抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率由低到高依次為L(zhǎng)+PT＜ PT＜ M+PT＜ H+PT。
　　結(jié)論:
　　酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，低劑量酯蟾毒配基對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有拮抗減效作用，中、高劑量酯蟾毒配基對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有協(xié)同增效作用。
　　第四章 機(jī)制研究
　　方法

12、:
　　選擇AffymetrixPrimeViewTMHuman Gene Expression Array表達(dá)譜芯片，用基因芯片篩查技術(shù)分析卵巢癌細(xì)胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基與順鉑聯(lián)合作用處理后基因表達(dá)的變化，利用生物信息學(xué)分析差異基因，通過表達(dá)模式聚類分析、GO富集分析、KEGG富集分析，尋找有顯著差異變化信號(hào)通路及關(guān)鍵分子，通過PCR、Western Blot方法檢測(cè)關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

13、　　結(jié)果:
　　1、酯蟾毒配基可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/CREB通路，促進(jìn)凋亡，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，是酯蟾毒配基影響順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用的關(guān)鍵所在。
　　2、PCR結(jié)果顯示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，AKT1不表達(dá);與空白對(duì)照組比較，酯蟾毒配基20μM組中CREB1水平無明顯差異(P＞0.05)，酯蟾毒配基100μM組中CREB1水平明顯增加(P＜0.05)。與順鉑5μM組比較，酯

14、蟾毒配基20μM+順鉑5μM組中CREB1水平無明顯差異(P＞0.05)，酯蟾毒配基100μM+順鉑5μM組中CREB1水平明顯增加(P＜0.05)。
　　3、Western Blot結(jié)果顯示，酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，與空白對(duì)照組比較，酯蟾毒配基20μM組、酯蟾毒配基100μM組中AKT水平均降低、Caspase3水平增高，磷酸化CREB水平均增高。與順鉑5μM組比較，酯蟾毒配基20μM+順鉑5μM組中AKT水平增

15、高、Caspase3水平降低，磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+順鉑5μM組中AKT水平降低、Caspase3水平增高，磷酸化CREB水平增高。
　　結(jié)論:
　　1、酯蟾毒配基通過PI3K/AKT/CREB通路，上調(diào)Caspase3水平，促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　2、CREB可能是卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑癌轉(zhuǎn)錄因子。
　　3、不同濃度的酯蟾