Sulforaphane拮抗砷吸入染毒致肺部損傷及其機制的研究.pdf

1、前言:
　　 砷是國際腫瘤研究機構(gòu)(IARC)確定的人類致癌物，砷的主要暴露途徑包括水、土壤和空氣。全球約有2億人受飲水型砷暴露的危害，據(jù)2005年的不完全統(tǒng)計，中國慢性飲水型高砷暴露人口已超過500萬，慢性飲水型砷中毒是我國面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。因此很多研究都是針對飲水型砷暴露展開的，也都取得了相應(yīng)的進展。但是由于砷暴露途徑的多樣性，砷中毒還存在其他的類型。在我國除飲水型砷中毒外，還包括燃煤型砷中毒，主要發(fā)生在貴州陜西等

2、地區(qū)，一些居民在通風條件差的環(huán)境下使用煤做飯、取暖、烘干食物，引發(fā)了嚴重的區(qū)域性砷中毒。煤炭引起的砷中毒，是中國特殊的砷健康問題。除此之外，采礦活動也會導致嚴重的砷污染，在美國干旱和半干旱的西南地區(qū)，存在一些尾礦和冶煉廠，亞利桑那州的Hayden-Winkleman和Iron King Mine這兩個礦附近，特別是其下風向地區(qū)的空氣中，發(fā)現(xiàn)高砷的灰塵，因此美國環(huán)境保護局已經(jīng)就這兩個礦的砷問題進行重點監(jiān)測。
　　 流行病學調(diào)查顯示

3、砷暴露和人類多種疾病，例如膀胱、皮膚和肺部等多器官的腫瘤產(chǎn)生直接相關(guān)。一項在美國人群中進行的為期一年的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，砷暴露所導致的肺癌病人超過了5000例。此外，很多研究發(fā)現(xiàn)砷暴露和許多肺部功能障礙，如慢性咳嗽、支氣管炎和呼吸急促等癥狀的發(fā)生有著極大的關(guān)系。因此針對砷暴露對肺部健康的不利影響的研究有著很大的意義。如果我們呼吸的空氣中含有高砷灰塵，那么砷就很可能對直接的靶器官肺部造成損傷。
　　 萊菔硫烷（Sulforapha

4、ne，SFN，SF，又名蘿卜硫素）是一種主要存在于西蘭花和其他十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽類物質(zhì)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Sulforaphane可以有效地預防肝癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生，是抗氧化、防癌、抗癌活性等最顯著的化合物。由于Sulforaphane的這種抗癌抗氧化的特性，不禁讓我們思索，Sulforaphane能否在阻止砷對機體產(chǎn)生氧化損傷的過程中產(chǎn)生一定作用。
　　 Sulforaphane的另一廣為人知的特性，即它是Nrf2

5、(Nuclear factor erythroid2-related factor2)的激動劑。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活化可以激活細胞防御系統(tǒng)來緩解藥物和污染物對機體的危害。這一過程主要是通過上調(diào)抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE）來實現(xiàn)的，其中主要包括谷氨酸半胱氨酸連接酶(其有兩個亞型γ-glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC/γ-glu

6、tamate cysteine ligase regulatory subunit，GCLM)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST），NAD(P)H醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1，NQO1)和血紅素單加氧酶1(Hemeoxygenase1，HO-1)。許多報告稱，Nrf2的活化被認為可以保護人體，對抗癌癥、神經(jīng)退行性疾病，肺功能障礙和急性肺損傷等

7、疾病。
　　 很多細胞實驗的證據(jù)已經(jīng)證明Nrf2在對抗砷毒性的重要作用，一項在小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）中的實驗發(fā)現(xiàn)，和Nrf2野生型(Nrf2-WT)小鼠胚胎成纖維細胞相比，砷對Nrf2敲除型(Nrf2-KO)小鼠的胚胎成纖維細胞的毒性作用更加明顯。特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)和Sulforaphane一樣，也是Nrf2常見的激

8、動劑，在UROtsa細胞中發(fā)現(xiàn)，這兩者可以降低無機砷(Inorganic arsenic，iAs)和一甲基機砷（Momomethylated arsenic，MMA）對細胞的毒性作用。在肝細胞中也發(fā)現(xiàn)了Sulforaphane可以降低砷毒性這類相似的結(jié)果。此外，Nrf2的其他激動劑如硫辛酸、肉桂醛和冬凌草均被發(fā)現(xiàn)在不同細胞中可以對抗砷產(chǎn)生的毒性，對細胞起到保護作用。
　　 在許多體內(nèi)實驗中也證實了Nrf2的保護效應(yīng)，一項動物實驗

9、結(jié)果，Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠飲用含亞砷酸鈉(Sodium arsenite，NaAsO2)的水6個月后，發(fā)現(xiàn)在Nrf2-KO小鼠中，發(fā)生的膀胱、肝臟和肺臟病理改變遠多于Nrf2-WT小鼠。現(xiàn)已有人群通過吸入含砷的顆粒暴露于砷的情況存在，然而針對吸入方法暴露于砷的實驗卻很少在嚙齒類動物中進行，因此通過吸入含砷顆粒染毒和激活機體Nrf2水平來探討其對肺臟的病理影響有著重要的現(xiàn)實意義。
　　 材料與方法:
　　 一

10、、動物模型的建立
　　 1、小鼠的飼養(yǎng)
　　 C57/BL6 Nrf2-WT基因型和Nrf2-KO基因型小鼠，年齡6-8周，4只一籠，飼養(yǎng)在聚碳酸酯鼠籠中，自由飲食（AIN-76A飼料）和飲水，12-12 h晝夜交替，室內(nèi)溫度在22±5℃，相對濕度在50±20％，由亞利桑那大學動物研究中心代為標準化飼養(yǎng)。
　　 2、小鼠的分組
　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠各分為4組:Con組、SF組、As組和

11、As+SF組（Con組=單純對照組，As組=As吸入式染毒組，SF組=SF干預組，As+SF組=As吸入式染毒合并SF干預組）。每組5只，共40只小鼠。
　　 3、染毒顆粒的準備
　　 染毒所用的含砷顆粒包括大小，直徑和空氣動力學等特性完全仿造于現(xiàn)實生活，合成的粉塵主要包括10％三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3），背景粉塵來自美國亞利桑那州公路粉塵，平均直徑約為2μm。
　　 4、染毒和干

12、預過程
　　 一個完全模仿外界的空間建立起來，24 h持續(xù)存在濃度100μg/m3的可吸入顆粒物（砷含量為10μg/m3）。但為了減小染毒過程中小鼠的應(yīng)激反應(yīng)，將暴露程度減小為可吸入顆粒物4.8 mg/m3每天30 min。小鼠被置于全身染毒系統(tǒng)（CH Technologies）暴露14天。Sulforaphane(Sigma)采用腹腔注射（intraperitoneally，i.p.）的方式以10 mg/kg的劑量隔天注射直到

13、為期14天的染毒結(jié)束，所有的40只小鼠均存活到實驗結(jié)束。
　　 二、小鼠支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage，BAL)的細胞分化分析
　　 經(jīng)14天砷吸入暴露染毒和Sulforaphane腹腔注射干預后，小鼠被麻醉，肺部經(jīng)0.5 ml磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）灌洗三次，收集的三次灌沈液中的細胞被重懸于PBS中，1500 rpm離心3 min后涂片和

14、染色，顯微鏡下計數(shù)200個細胞用于細胞分化分析。數(shù)據(jù)通過Mean±SD(n=5)來表示。
　　 三、小鼠支氣管肺泡灌洗細胞因子的測量
　　 小鼠經(jīng)14天砷吸入暴露染毒和Sulforaphane腹腔注射干預后被麻醉，肺部用0.5 ml PBS灌洗三次，第一次的支氣管肺泡灌洗液的上清被儲存在-80℃的冰箱(Thermo)里直到測量細胞因子。細胞因子包括白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度采用eBios

15、cience公司的IL-6和TNF-αReady-SET-Go試劑盒。數(shù)據(jù)通過Mean±SD(n=5)來表示。
　　 四、小鼠肺部組織切片蘇木素-伊藍染色(Hematoxylin andEosin, H&E)
　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福爾馬林中固定，30％-50％-75％酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm組織切片經(jīng)蘇木素-伊藍染色后，于光學顯微鏡(Nikon)下應(yīng)用軟件NIS-ELEMENTS F

16、30拍照，分析其病理損傷情況。
　　 五、小鼠肺部組織切片細胞凋亡檢測
　　 Nrf2-WT小鼠肺部于10％福爾馬林中固定，30％-50％-75％酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm組織切片經(jīng)羅氏公司細胞凋亡檢測程序試劑盒(In situ cell deathdetection kit)染色，之后用核染劑Hoechst3334(Cell Signaling Technology)為組織的細胞核染色。在熒光顯微鏡(Zeiss O

17、bserver)應(yīng)用Z1 microscope with theSlidebook computer program下觀察拍照，分析其細胞凋亡情況。
　　 六、小鼠肺組織免疫印跡分析(Western Blot)
　　 在支氣管肺泡灌洗液收集之后，分離小鼠的肺部為三部分，一部分于液氮速凍，之后置于-80℃保存直至蛋白分析檢測使用。小鼠肺組織于蛋白裂解液進行蛋白提取和制備后，200μg/孔于聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium

18、dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE），檢測Nrf2,NQO1,HO-1,γ-GCS，p-65，P-p65和β-actin蛋白，應(yīng)用成像系統(tǒng)掃描發(fā)光條帶，并掃描灰度值進行分析。
　　 七、小鼠肺組織免疫組織化學分析(Immunohistochemical，IHC)
　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福爾馬林中固定，30％

19、-50％-75％酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm組織切片針對Nrf2蛋白進行免疫組織化學染色，并于蘇木素復染后，光學顯微鏡下應(yīng)用軟件NIS-ELEMENTS F30拍照，觀察Nrf2蛋白表達情況。
　　 八、小鼠肺組織DNA氧化損傷檢測
　　 Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠肺部于10％福爾馬林中固定，30％-50％-75％酒精脫水，石蠟包埋，切成5μm組織切片針對多克隆抗體8-羥基-2'-脫氧鳥苷(8-Oxo-7，8-

20、dihydro-2'-deoxyguanosine，8-Oxo-dG)，購于Trevigen進行免疫組織化學分析。最后經(jīng)蘇木素復染后，于光學顯微鏡下應(yīng)用軟件NIS-ELEMENTS F30拍照，檢測DNA氧化損傷。
　　 九、逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(quantitativereal-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)
　　 在支氣管肺泡灌洗液收集之后，分離小鼠的

21、肺部為三部分，一部分于液氮速凍，之后置于-80℃保存直至RNA分析檢測使用。用TRIzol(Invitrogen)提取肺組織總RNA，總RNA經(jīng)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶和OligodT，Random6 mers，dNTP將等量的RNA(1μg)轉(zhuǎn)錄為cDNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA使用ABIPRISM7500 Sequence Detector(Applied Biosystems) PCR儀，引物設(shè)計如下:
　　 NQO

22、1: GGTAGCGGCTCCATGTACTC(forward);
　　 AGACCTGGAAGCCACAGAAA(reverse)
　　 HO-1:GAGCCTGAATCGAGCAGAAC(forward);
　　 CTCGGCTTGGATGTGTACCT(reverse)
　　 GCLM: TCCCATGCAGTGGAGAAGAT(forward);
　　 AGCTGTGCAACTCCAAGG

23、AC(reverse)
　　 β-actin: AAGGCCAACCGTGAAAAGAT(forward);
　　 GTGGTACGACCAGAGGCATAC(reverse)
　　 IL-13: CAAGACCAGACTCCCCTGTG(forward);
　　 AGGCCATGCAATATCCTCTG(reverse)
　　 IL-4:CCAAGGTGCTTCGCATATTT(forward)

24、;
　　 ATCGAAAAGCCCGAAAGAGT(reverse)
　　 TGF-β:GACTCTCCACCTGCAAGACC(forward);
　　 GACTGGCGAGCCTTAGTTTG(reverse)
　　 MCP-1:CCCAATGAGTAGGCTGGAGA(forward);
　　 TCTGGACCCATTCCTTCTTG(reverse)
　　 實時熒光定量核酸擴增cD

25、NA:變性過程，1個循環(huán)(95℃，3 min);擴增過程，40個循環(huán)(95℃，10 s，60℃，20 s，72℃，5 s)，溶解曲線測量，1個循環(huán)(95℃，5s,65℃，60s)，溫度升高到97℃，5-10 acquisition/℃，降溫過程(40℃，30 s)。實時熒光檢測使用的Lightcycler PCR儀(Roche)和Roche480軟件檢測?；虮磉_的相對差異由基因的循環(huán)數(shù)（Ct值）計算得出，結(jié)果最終用看家基因β-acti

26、n校正。Nrf2-WT的對照組被設(shè)定為1。
　　 十、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件（芝加哥，美國）對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)((x)±sd)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)比較各實驗組與對照組間的統(tǒng)計學差異，組間兩兩比較采用Dunnett's檢驗，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、砷吸入式暴露和Sulforaphane干預下小鼠肺部Nrf2及其下游部

27、分抗氧化物酶水平均呈升高趨勢。
　　 盡管在一些細胞系和飲水型暴露條件下，砷可以激動Nrf2使其水平升高已經(jīng)得到證實，但是通過吸入式進行砷暴露，觀察對Nrf2的影響沒有許多諸如此類的研究。本實驗檢測了Nrf2-WT小鼠通過吸入式暴露于砷14天后的肺組織Nrf2及其下游部分基因的表達情況，免疫印跡分析和免疫組織化學分析均顯示Nrf2蛋白明顯升高。腹腔注射Sulforaphane的小鼠肺部Nrf2蛋白水平同樣也呈升高趨勢，但砷暴露同

28、時合并Sulforaphane干預組Nrf2蛋白升高水平是最顯著的。和Nrf2相似的結(jié)果，其下游基因包括NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白水平在三個組均出現(xiàn)升高情況，基本上As+SF組的升高是最明顯的。和預期一致的，Nrf2-KO組的小鼠蛋白檢測時無法檢測到Nrf2，其下游基因NQO1、HO-1和γ-GCS水平也呈基礎(chǔ)狀態(tài)，免疫組化也未見Nrf2蛋白表達。在mRNA水平檢測時，Nrf2-KO組的NQO1、GCLM和HO-1的mRNA水平

29、均低于相應(yīng)的Nrf2-WT組。
　　 2、Sulforaphane能夠降低砷吸入式暴露下小鼠肺部的病理損傷，氧化損傷和細胞凋亡。
　　 肺組織學檢查表明，Nrf2-WT和Nrf2-KO空白對照組的小鼠肺泡上皮細胞薄薄一層，而且只有少量浸潤的炎癥細胞。注射Sulforaphane對兩組小鼠肺組織的形態(tài)沒有明顯影響。在Nrf2-WT和Nrf2-KO組均可見砷暴露導致肺泡間隔顯著增厚，膠原沉積增加，成纖維細胞增殖，肺泡增生。此

30、外，還可見一些浸潤淋巴細胞。值得注意的是，在Nrf2-WT的SF組小鼠中，并沒有觀察到所有砷暴露組的變化，表明Sulforaphane是可以防止Nrf2-WT小鼠砷暴露造成的的肺組織的病理變化。相反，從Nrf2-KO的SF組小鼠的肺組織切片可以看出砷暴露的改變沒有得到緩解，表明Sulforaphane對砷誘導的肺損傷的保護作用的是具有Nrf2依賴性的。
　　 通過針對肺部8-Oxo-dG水平的免疫組化檢測了砷導致的DNA氧化損傷

31、情況。在Nrf2-WT和Nrf2-KO的砷暴露組均可見小鼠肺部切片的DNA氧化損傷增加。兩組的Sulforaphane干預組均未見DNA氧化損傷，反而在Nrf2-WT的As+SF組，砷導致的DNA氧化損傷明顯下降，說明Sulforaphane可以降低砷暴露導致的氧化損傷情況，不過在Nrf2-KO的As+SF組未見DNA氧化損傷降低的情況。
　　 此外，用Tunel熒光檢測了凋亡細胞情況，Tunel是針對凋亡細胞的細胞核進行染色的

32、，在Nrf2-WT的Con組和SF組均未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的情況，As組和As+SF組均出現(xiàn)了凋亡細胞，但同時發(fā)現(xiàn)As+SF組的細胞凋亡情況明顯少于As組。此外還用Hoechst染核來確定了Tunel熒光標記的細胞核特異性。
　　 3、Sulforaphane能夠緩解砷吸入式暴露下小鼠肺部炎癥細胞的浸潤。
　　 典型的肺吸入有毒顆粒物的反應(yīng)是炎性細胞的浸潤。砷暴露后，Nrf2-WT和Nrf2-KO兩組總的支氣管肺泡灌洗液中的炎

33、癥細胞數(shù)目明顯增加。Sulforaphane的干預降低了Nrf2-WT小鼠支氣管肺泡灌洗液的總細胞計數(shù)，但對Nrf2-KO的小鼠沒有影響。Sulforaphane單獨干預對Nrf2-WT或Nrf2-KO小鼠的肺不會引起任何炎癥情況。對巨噬細胞，嗜中性粒細胞和淋巴細胞的分別計數(shù)也得到了和細胞總數(shù)類似的趨勢?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，Sulforaphane可以激活Nrf2使其能夠抑制砷吸入引起的肺部炎癥反應(yīng)。
　　 TNF-α是一種

34、多功能的促炎細胞因子，可被砷暴露誘導增高。在這項研究中，通過ELISA分析檢測發(fā)現(xiàn)砷吸入后支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象。有趣的是，Sulforaphane的干預明顯著減少了Nrf2-WT小鼠的支氣管肺泡灌洗液TNF-α的釋放，但并不對Nrf2-KO小鼠產(chǎn)生影響。TNF-α不僅是轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的靶基因，也可以激活NF-κB途徑，導致p65的第536位點的絲氨酸的磷酸化。p65是NF-κB的一類亞基，可以調(diào)節(jié)包括細胞

35、因子，諸如IL-6，有助于修復炎癥損傷和損傷肺部的重構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)，砷吸入暴露后激活NF-κB信號通路，增強p65的磷酸化(P-p65)，而總p65沒有發(fā)生變化。Sulforaphane的干預抑制了Nrf2-WT小鼠在砷暴露后磷酸化p65的增加，但對Nrf2-KO小鼠沒有影響。支氣管肺泡灌洗液中的IL-6在砷暴露后也呈增加趨勢，這也證實了砷激活了NF-κB通路。Sulforaphane干預在Nrf2-WT小鼠中減低了IL-6的增長程度，但

36、對Nrf2-KO小鼠沒有影響。這之后的qRT-PCR檢測mRNA水平進一步分析表明，砷暴露導致產(chǎn)生的Th2型細胞因子增加，包括IL-13和IL-4，在Nrf2-WT小鼠中，Sulforaphane可以抑制其增加趨勢，但對Nrf2-KO小鼠不起作用（IL-13:統(tǒng)計學顯著;IL-4:顯著趨勢）。此外，砷暴露導致轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）升高，同時升高的還有單核細胞趨化蛋白-1(

37、Monocyte chemotactic protein1，MCP-1)，它是T淋巴細胞浸潤的巨噬細胞和上皮細胞產(chǎn)生的趨化因子。Nrf2-WT小鼠的TGF-β和MCP-1在Sulforaphane的干預下，砷暴露組呈輕微下降趨勢，Nrf2-KO小鼠未見變化。結(jié)合數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)砷暴露使小鼠的支氣管肺泡灌洗液中淋巴細胞增多，表明砷可以誘導過敏性肺部炎癥反應(yīng)。值得注意的是，Sulforaphane在Nrf2-WT小鼠中可以抑制砷誘導的Th2細胞因子

38、（IL-13和IL-4）和MCP-1，但對Nrf2-KO小鼠沒有效果，表示的Sulforaphane的抗炎活性是具有Nrf2依賴性的。
　　 結(jié)論:
　　 1、砷吸入式暴露和Sulforaphane干預下小鼠肺部轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游部分抗氧化物酶水平呈升高趨勢。
　　 2、Sulforaphane能夠降低砷吸入式暴露下小鼠肺部的病理損傷，氧化損傷和細胞凋亡。
　　 3、Sulforaphane能夠緩解