甲醛吸入染毒致大鼠肺損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、甲醛是一個(gè)普遍存在的化學(xué)物，在服裝、食物、室內(nèi)空氣、汽油和柴油尾氣等中無所不在。它屬于揮發(fā)性有機(jī)化合物，溶液的沸點(diǎn)是-19℃，在室溫時(shí)極易揮發(fā)，氣態(tài)甲醛對(duì)人體健康危害更大。其健康危害主要包括感官刺激、過敏反應(yīng)和各種基因毒性。大鼠長(zhǎng)期吸入實(shí)驗(yàn)已表明甲醛是一個(gè)鼻致癌物。2004年WHO將其由2A致癌原提升為1A致癌原，即“確認(rèn)的人類致癌原”。目前，氣態(tài)甲醛毒性效應(yīng)是明確的，但其分子機(jī)制研究很不深入。根據(jù)現(xiàn)有資料分析，甲醛的健康危害一般與大分

2、子蛋白質(zhì)有關(guān)，因此，本文擬應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來探索甲醛的毒性效應(yīng)機(jī)理，并在蛋白質(zhì)水平上來尋找其接觸與效應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物。 隨著2003年4月14日人類基因組計(jì)劃的成功完成及后基因組時(shí)代的到來，蛋白質(zhì)組的研究已成為生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要領(lǐng)域?！暗鞍踪|(zhì)組”一詞是澳大利亞Macquaire大學(xué)的Wilkins和Williams于1994年提出，“指一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。功能蛋白質(zhì)組概念的提出為我們進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究提供了依據(jù)。目

3、前，有關(guān)甲醛的研究主要是環(huán)境監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查，分子水平上多集中于DNA損傷研究，尚無蛋白質(zhì)組水平的研究報(bào)道。 呼吸系統(tǒng)是甲醛毒性作用的主要靶點(diǎn)。有資料顯示，甲醛吸入染毒后，大鼠肺內(nèi)甲醛含量比血、腦、肝、腎中高。但目前有關(guān)甲醛的研究多集中于上呼吸道，尤其是鼻腔，吸入暴露引起的肺損害研究非常有限。本研究的目的是應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析大鼠吸入甲醛后其肺內(nèi)的蛋白質(zhì)改變，并對(duì)蛋白質(zhì)改變的機(jī)制和功能進(jìn)行探討和研究。結(jié)果如下： 1、

4、建立了正常大鼠肺蛋白質(zhì)組雙向電泳(2-DE)技術(shù)。通過對(duì)蛋白定量、樣品制備、第一向和第二向電泳中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行控制和優(yōu)化，獲得了分辨率和重復(fù)性均較高的蛋白質(zhì)2-DE圖譜。正常大鼠肺在18cmpH=3-10L的膠上可分離大約720個(gè)點(diǎn)，且分離效果較好；蛋白質(zhì)點(diǎn)平均匹配率為72.2％。這一技術(shù)的建立，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。 2、獲得了甲醛吸入染毒后大鼠肺蛋白質(zhì)組2-DE差異表達(dá)譜。首先建立了大鼠不同濃度甲醛(0、15-20、32

5、-37mg/m3)亞急性(4h/d，15d)吸入染毒模型；其次獲得了甲醛吸入染毒后大鼠肺蛋白質(zhì)組2-DE差異表達(dá)譜：肺樣品溶解并經(jīng)2-DE分離后，凝膠圖譜被掃描和分析以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。在甲醛暴露組發(fā)現(xiàn)13個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中4個(gè)在高濃度甲醛組顯著上調(diào)；2個(gè)在高濃度組顯著下調(diào)；4個(gè)只在高濃度組表達(dá)；1個(gè)在低濃度和高濃度組表達(dá)均顯著增高，呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系；2個(gè)在低濃度和高濃度組表達(dá)均顯著增高，但不呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。 3、采用

6、質(zhì)譜法鑒定了2-DE圖譜上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并探討了這些蛋白質(zhì)與甲醛毒性的關(guān)系。 通過膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF-MS檢測(cè)和NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋，成功鑒定6個(gè)蛋白質(zhì)，分別為：醛糖還原酶、LIM蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、細(xì)胞內(nèi)氯離子通道3和細(xì)胞色素P450，其中有兩個(gè)蛋白質(zhì)均為細(xì)胞內(nèi)氯離子通道3。對(duì)差異蛋白質(zhì)中的醛糖還原酶進(jìn)行了酶活性測(cè)試，結(jié)果與其在2-DE圖譜上表達(dá)量的變化一致。組織病理學(xué)研究表明，2-DE圖譜上甘油

7、醛-3-磷酸脫氫酶和細(xì)胞色素P450的表達(dá)變化與大鼠肺超微結(jié)構(gòu)受損有關(guān)。 4、對(duì)醛糖還原酶(AAAR)表達(dá)升高的機(jī)制及其功能作了進(jìn)一步研究。暴露于甲醛的大鼠由于活性氧的形成和抗氧化能力的下降可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而AR表達(dá)增高可能減少由于氧化應(yīng)激所致的大鼠肺損害。通過細(xì)胞培養(yǎng)、AR活性測(cè)定、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)抑制AR可使大鼠肺細(xì)胞凋亡增加，因而認(rèn)為AR具有抗氧化作用，對(duì)大鼠肺細(xì)胞具有保護(hù)功能。 總之，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方