粗糙型布魯菌激活四型分泌系統(tǒng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、布魯菌是人畜共患布魯菌病的病原菌，主要引起動物流產(chǎn)和人的波狀熱。布魯菌的毒力主要體現(xiàn)在入侵吞噬細(xì)胞并在胞內(nèi)存活和復(fù)制的能力。布魯菌侵入宿主細(xì)胞后通過表達(dá)一系列的毒力相關(guān)因子來完成胞內(nèi)存活和復(fù)制過程，脂多糖(LPS)和Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)是布魯菌最為關(guān)鍵的兩個毒力相關(guān)因子。根據(jù)LPS的完整性，將布魯菌分為光滑型（S型）和粗糙型（R型）。R型布魯菌能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡，并且該過程依賴于T4SS。然而，R型布魯菌致死巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制還不

2、清楚。本研究利用Luciferase報告基因、Western blotting、qPCR等方法對其進(jìn)行了探究，并且利用Label-free蛋白組學(xué)技術(shù)對T4SS關(guān)鍵效應(yīng)蛋白進(jìn)行篩選鑒定。
　　本研究中，為確定T4SS在R型布魯菌ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用，我們利用FITC-Annexin V/propidium iodide雙熒光染色法和檢測乳酸脫氫酶釋放量兩種方法對S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬細(xì)

3、胞后的細(xì)胞毒性分別進(jìn)行定性和定量檢測。結(jié)果顯示，R型布魯菌ΔrfbE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡依賴于T4SS。
　　為探究T4SS在ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用，構(gòu)建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase報告菌株對S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明顯高于S2308。進(jìn)一步對S2308和ΔrfbE

4、的T4SS表達(dá)差異分別用qPCR和Western blotting進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在TSB、酸性和營養(yǎng)匱乏條件下，R型布魯菌ΔrfbE的T4SS表達(dá)量顯著高于S型布魯菌S2308。T4SS啟動子virB的Luciferase報告菌株的檢測結(jié)果表明，ΔrfbE的virB啟動子活性顯著高于S2308。上述試驗結(jié)果表明，T4SS的表達(dá)和分泌能力在R型布魯菌中顯著高于S型布魯菌。
　　為探究R型布魯菌ΔrfbET4SS上調(diào)表達(dá)的原因，

5、我們利用qPCR分析了T4SS的調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與S2308相比，ΔrfbE的VjbR上調(diào)表達(dá)，MdrA和BlxR下調(diào)表達(dá)。為確定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞中的作用，構(gòu)建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的過表達(dá)菌株，并對這些菌株的細(xì)胞毒性進(jìn)行了定性和定量檢測。結(jié)果表明，ΔrfbE缺失VjbR后不再具有細(xì)胞毒性;ΔrfbE過表達(dá)BlxR后細(xì)胞毒性顯著降低;但ΔrfbE過表達(dá)Md

6、rA后細(xì)胞毒性仍然很強。為研究VjbR和BlxR對T4SS的調(diào)控作用，我們利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE(pBlxR)菌株的virB4的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，VjbR對ΔrfbE的T4SS過表達(dá)起到了關(guān)鍵的作用，而BlxR只起到了一定的作用。R型布魯菌激活巨噬細(xì)胞凋亡或焦亡與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激IRE1α信號通路相關(guān)，為探究R型布魯菌ΔrfbE的T4SS分泌上調(diào)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，利用Western blotting鑒定

7、了S2308和ΔrfbE感染巨噬細(xì)胞后IRE1α磷酸化(p-IRE1α)水平。結(jié)果顯示，與S2308相比，ΔrfbE引起更強烈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。運用p-IRE1α專性抑制劑4μ8c處理細(xì)胞后檢測ΔrfbE對巨噬細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，抑制p-IRE1α后ΔrfbE對巨噬細(xì)胞的毒性顯著降低。該系列結(jié)果表明，R型布魯菌通過VjbR上調(diào)和BlxR下調(diào)表達(dá)協(xié)同調(diào)控T4SS的轉(zhuǎn)錄并激活I(lǐng)RE1α信號通路致死巨噬細(xì)胞。
　　我們對S2308、ΔrfbE

8、和ΔrfbEΔvirB12進(jìn)行了差異分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以期篩選到致死巨噬細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用的T4SS效應(yīng)蛋白。將三個菌株在RPMI-1640營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基中誘導(dǎo)8h制備分泌蛋白樣品，發(fā)現(xiàn)R型布魯菌的蛋白分泌量明顯高于S型布魯菌。質(zhì)譜分析共鑒定肽段數(shù)9020個，蛋白質(zhì)組數(shù)1131個。GO分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要參與細(xì)胞過程和代謝過程等重要的生物學(xué)過程，集中分布在細(xì)胞和細(xì)胞組分，具有催化活性和結(jié)合活性的分子功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主

9、要位于氨基酸的生物合成、雙組份系統(tǒng)、碳代謝、嘌呤代謝、核糖體、NOD樣受體信號通路、細(xì)菌分泌系統(tǒng)等重要通路。運用細(xì)菌的定向缺失和過表達(dá)技術(shù)分析了差異分泌蛋白對S型和R型布魯菌細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果顯示，OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB11185)與布魯菌的細(xì)胞毒性密切相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)R型布魯菌ΔrfbE致死巨噬細(xì)胞與其T4SS的組分無關(guān)，而是T4SS分泌的某些效應(yīng)蛋白起到了關(guān)鍵作用。
　　綜上所述，本研究揭示