水稻黃單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)酚類化合物抑制劑的篩選及其機(jī)制研究.pdf

1、傳統(tǒng)抗生素通常以細(xì)菌生存的關(guān)鍵因素為作用靶標(biāo)，導(dǎo)致細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生越來越普遍和嚴(yán)重。因此，靶向細(xì)菌毒性因子、而不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，成為抗菌藥物研發(fā)的新思路和新途徑。細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)（T3SS）是革蘭氏陰性病原細(xì)菌中的關(guān)鍵毒性因子，已經(jīng)成為了研發(fā)新型藥物的理想靶標(biāo)之一。水稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo）和細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）

2、分別引起白葉枯病和條斑病，是水稻上重要的細(xì)菌性病害，研發(fā)新型有效的病害防治新藥物是迫切需要解決的關(guān)鍵問題之一。T3SS是Xoo和Xoc的關(guān)鍵毒性因子，在兩個(gè)致病變種中高度同源和保守，可以用作新型藥物分子設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。因此，本研究鑒定了4種對(duì)其T3SS的功能有抑制作用的酚類化合物，探討了它們抑制作用的分子機(jī)制，為其進(jìn)一步在生產(chǎn)實(shí)際的病害防控中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究結(jié)果如下：
　　1.水稻白葉枯病菌T3SS抑制劑的篩選和鑒定
　

3、　選用了一個(gè)編碼harpin蛋白（一個(gè)T3SS分泌蛋白）的hpa1基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建了綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告系統(tǒng)；利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了酚類化合物對(duì)Xoo菌株P(guān)XO99AT3SS的影響，以篩選出相應(yīng)的抑制劑。在hrp基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基XOM2中添加不同酚類化合物，檢測(cè)細(xì)菌hpa1基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，在檢測(cè)的45種化合物中，以對(duì)hpa1基因的啟動(dòng)子活性抑制率高于60％為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到10種可能的T3SS抑制劑。隨后，檢測(cè)了它們對(duì)Xoo

4、在非寄主煙草上引起過敏性反應(yīng)（HR）能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種酚類化合物（TS006，TS010，TS015和TS018）完全抑制了Xoo在煙草上誘導(dǎo)HR的能力，并且它們對(duì)Xoo各生長(zhǎng)階段都未發(fā)現(xiàn)有抑制作用。以上結(jié)果說明，TS006，TS010，TS015和TS018是通過影響T3SS功能，而非細(xì)菌生長(zhǎng)，影響了Xoo煙草誘導(dǎo)HR的能力。
　　2.水稻白葉枯病菌T3SS抑制劑的作用機(jī)制
　　為了進(jìn)一步揭示這4種抑制劑抑制T3S

5、S功能的分子機(jī)制，選取了hrp基因簇中hrpB和hrcC基因啟動(dòng)子，檢測(cè)這4種抑制劑對(duì)它們活性的影響。hrpB基因啟動(dòng)子中含有一個(gè)完整的受HrpX調(diào)控的PIP-box,而hrcC啟動(dòng)子中不含有PIP-box。結(jié)果顯示，hrpB啟動(dòng)子活性被4種抑制劑顯著抑制，而hrcC啟動(dòng)子活性不被抑制。通過qRT-PCR檢測(cè)了不同類型hrp基因的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hpa1、hrpE、hrpF、hrcC、hrcT、hrcU以及調(diào)控基因 hrpG和hr

6、pX的轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的降低，表明4種抑制劑影響了Xoo中T3SS的表達(dá)水平，而且可能是通過HrpG/HrpX的調(diào)控途徑來實(shí)現(xiàn)的。采用Cya-轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4種抑制劑對(duì)兩個(gè)T3SS的Non-TAL效應(yīng)子（PXO_04172和PXO_03702）轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。另外，檢測(cè)了4種抑制劑對(duì)gum基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)gum基因mRNA水平并沒有降低，表明4種抑制劑可能并不影響EPS的產(chǎn)生。
　　3.T3SS抑制劑對(duì)水稻白葉枯病菌和細(xì)菌

7、性條斑病菌致病性的影響
　　檢測(cè)了4種T3SS抑制劑是否抑制Xoo和Xoc對(duì)水稻的致病性。結(jié)果表明，在水稻感病品種IR24幼苗葉片上，Xoo引起的水漬狀病斑以及Xoc引起的病癥均可被TS006，TS010，TS015，TS018顯著地抑制。而在IR24成株葉片上，Xoo和Xoc引起的白葉枯和條斑病害癥狀也在不同程度上被抑制。
　　總之，本研究鑒定出了4個(gè)T3SS抑制劑，揭示了它們可能通過HrpG/HrpX調(diào)控途徑影響了hrp