V型分泌系統(tǒng)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、革蘭氏陰性細(xì)菌通過不同的分泌系統(tǒng)向胞外分泌不同的蛋白來維持細(xì)胞的生理功能，如信號傳導(dǎo)、營養(yǎng)汲取、免疫和毒性等。目前，革蘭氏陰性細(xì)菌已鑒定出八個不同的分泌系統(tǒng)，即Ⅰ-Ⅷ型分泌系統(tǒng)或T1SS-T8SS。本論文主要對T5SS和T6SS相關(guān)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究。
　　T5SS在致病性細(xì)菌中廣泛存在，其能夠分泌蛋白酶，黏附素，致病因子等一些外膜蛋白。這些分泌的蛋白通過Sec途徑分泌到細(xì)胞周質(zhì)空間，然后通過BAM復(fù)合物將這些非成熟蛋白進(jìn)行

2、折疊并分泌到外膜。
　　BAM復(fù)合物共包含五個蛋白命名為BamA-E，BamA為外膜蛋白，BamB/C/D/E是四個脂蛋白。本論文對BamB/C/D/E進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化，并成功解析了BamB和BamD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，為解釋BAM復(fù)合物的運(yùn)輸機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　BamB晶體的分辨率為2.0(A)，整體結(jié)構(gòu)由八個片狀的螺旋槳組成，通過Pull-down和Western blotting實驗分析，BamB直接與BamA

3、的POTRA1-3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，POTRA1-3的C端對于結(jié)合起到重要的作用。
　　BamD晶體分辨率為2.6(A)，整體結(jié)構(gòu)由五個TPR結(jié)構(gòu)域組成。通過結(jié)構(gòu)分析，BamD的第十個α螺旋對于BAM復(fù)合物的組裝很重要。BamD的N端結(jié)構(gòu)對于其它外膜蛋白的分泌具有重要作用，而C端結(jié)構(gòu)主要用于結(jié)合BAM復(fù)合物中的其它蛋白。
　　T6SS是最近在革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一個動態(tài)多組分大分子裝置，對于革蘭氏陰性細(xì)菌的生存競爭具有重要意義。

4、T6SS和噬菌體攻擊靶細(xì)胞具有同源性，能夠向宿主細(xì)胞分泌大量的具有毒性的效應(yīng)因子，這些效應(yīng)因子能夠降解細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡。為了保護(hù)自身細(xì)胞，每種效應(yīng)蛋白都有對應(yīng)的免疫蛋白，阻止效應(yīng)蛋白的催化作用。
　　本論文解析了酰胺酶效應(yīng)因子Tae3和相應(yīng)的免疫蛋白Tai3的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，糖苷水解酶VgrG3C和相應(yīng)的免疫蛋白TsaB的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。
　　通過晶體學(xué)和小角X射線散射分析，Tae3-Tai3復(fù)合物在溶液中以異

5、源六聚體的形式存在，即兩個Tae3結(jié)合四個Tai3分子。Tae3的23位半胱氨酸和81位組氨酸形成兩個催化二元體殘基，其突變體C23A、H81A能夠?qū)е耇ae3的酰胺酶活性失活。Tai3的α3-α4之間的loop插入到Tae3的活性位點，從而抑制Tae3的活性，而且Tai3的高保守殘基Gln91-Asp92-Tyr93對于抑制機(jī)制起到非常重要的作用。
　　VgrG3C-TsaB在溶液中以異源四聚體的形式存在，即兩個VgrG3C結(jié)合

6、兩個TsaB蛋白。VgrG3C顯示一種T4溶菌酶的折疊構(gòu)象，具有反轉(zhuǎn)糖苷水解酶的特性，通過細(xì)胞毒性實驗，發(fā)現(xiàn)VgrG3C的兩個高保守殘基Glu827和Asp842具有催化活性，形式催化二元體。TsaB通過模擬底物的形式，直接插入到VgrG3C的活性溝槽，占據(jù)活性位點，從而阻斷了VgrG3C與底物的結(jié)合。
　　通過Tae3-Tai3復(fù)合物和VgrG3C-TsaB復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)研究，提出了免疫蛋白抑制效應(yīng)蛋白的具體機(jī)制，為設(shè)計藥物靶點