低濃度MNNG誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞過程中Shh信號通路的動態(tài)觀察.pdf

1、目的：探討低濃度MNNG（N-甲基-N＇-硝基-N-亞硝基胍）誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞（人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞）轉(zhuǎn)化為MC細(xì)胞（轉(zhuǎn)化細(xì)胞）過程中Shh信號通路的表達(dá)。
　　 方法：取預(yù)先凍存的GES-1細(xì)胞，復(fù)蘇，傳代，待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，放入6mm 培養(yǎng)皿中。取配制好的0.01mol/L的MNNG 儲存液，加入生長旺盛的GES-1細(xì)胞中，終濃度為2×10-5mol/ L，避光培養(yǎng)24h后，更換不含MNNG的培養(yǎng)液。分別

2、收集GES-1細(xì)胞（對照組，未加MNNG），0天（剛更換不含MNNG的培養(yǎng)基），3天，7天的MC細(xì)胞（標(biāo)記為MC0、MC3、MC7）。RT-PCR分別檢測ShhmRNA與Gli-1mRNA在GES-1、MC0、MC3、MC7的表達(dá)，RT-PCR 產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像系統(tǒng)拍照分析，不同組比較采用Shh、Gli-1/GAPDH 相對強(qiáng)度比值，試驗(yàn)重復(fù)3次。免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測Shh與Gli-1蛋白在GES-1、MC0、MC3、M

3、C7的表達(dá)，用Image-pro plus5.0圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。
　　 結(jié)果：RT-PCR 結(jié)果顯示ShhmRNA在GES-1細(xì)胞中陰性表達(dá)，在MC0、MC3、MC7細(xì)胞中表達(dá)陽性，并呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢， Gli-1mRNA在GES-1細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，在MC0、MC3、MC7細(xì)胞中表達(dá)陽性，表達(dá)也逐漸增強(qiáng)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Shh蛋白在GES-1細(xì)胞中不著色（陰性表達(dá)），在MC0、MC3、MC7細(xì)胞中著色逐漸