低濃度Etoposide誘導乳腺癌細胞衰老過程中Hippo通路的影響及組織蛋白酶D表達變化的研究.pdf

1、目的:依托泊苷(etoposide)作為抗腫瘤藥，可以通過抑制腫瘤細胞內DNA及蛋白質合成發(fā)揮抑癌作用。有報道稱:大劑量etoposide可以誘導腫瘤細胞凋亡，而小劑量etoposide則能誘導腫瘤細胞衰老。本研究擬對比不同濃度etoposide誘導人乳腺癌細胞MCF-7衰老的差異，觀察細胞形態(tài)學改變及增殖情況，進行衰老相關β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，建立低濃度etoposide誘導人乳腺癌細胞MCF-7衰老模型;明確在低濃度

2、etoposide誘導的人乳腺癌細胞MCF-7衰老過程中，Hippo通路活性的改變;解析Hippo通路活性的改變對低濃度etoposide誘導人乳腺癌細胞MCF-7衰老的影響;闡明低濃度etoposide誘導MCF-7衰老過程中，組織蛋白酶D的表達變化。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)MCF-7，分別用不同濃度etoposide(0、3.125、6.25、12.5μM)處理48 h，通過觀察細胞形態(tài)學改變和進行衰老相關β半

3、乳糖苷酶染色來評估細胞的衰老程度，建立細胞衰老模型。
　　2.MTS法檢測細胞活力、繪制細胞生存率曲線，分析etoposide對細胞增殖的影響。
　　3.Western blot檢測Hippo通路相關蛋白、組織蛋白酶等在蛋白水平的表達變化，包括YAP、p-YAP、LATS1、p-LATS1、CTSD。
　　4.細胞免疫熒光染色對比etoposide處理后YAP在細胞內分布變化。
　　5.質粒轉染抑制p-YAP的生

4、成，明確YAP表達對腫瘤細胞衰老的影響。
　　結果:
　　1.不同濃度etoposide（0、3.125、6.25、12.5μM）誘導人乳腺癌細胞MCF-748 h，與對照組相比，普通光學顯微鏡下觀察，etoposide處理組細胞體積明顯變大、細胞數(shù)量少，而且衰老特異性SA-β-gal染色陽性的細胞數(shù)明顯增加，對照組與各實驗組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.不同濃度etoposide處理人乳腺癌細胞

5、MCF-7后，MTS法檢測發(fā)現(xiàn)etoposide對細胞增殖抑制作用明顯，并呈劑量依賴性，各組之間的差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.Etoposide處理MCF-7細胞后在不同作用時間點(0 min、5 min、10 min、30 min、1h、4h、24 h、48 h)收集細胞，結果發(fā)現(xiàn)p-LATS1呈一過性表達增高， p-YAP蛋白表達水平則呈持續(xù)性增高的狀態(tài)。
　　4.不同濃度etoposide處理MCF-7細胞24h，細胞

6、免疫熒光染色顯示，對照組細胞YAP基本在細胞核內表達，隨給藥濃度的增加，YAP在細胞質內表達增加。不同濃度etoposide處理MCF-7細胞48h后，細胞免疫熒光染色顯示，各實驗組細胞中YAP在細胞核外表達明顯增加，且表達量高于誘導24 h，對照組仍然分布于細胞核內。
　　5.通過質粒轉染法誘導YAP持續(xù)入核，抑制YAP蛋白磷酸化，etoposide誘導后，與未轉染組細胞相比，實驗組YAP蛋白細胞質中表達減少。
　　6.E