孟德?tīng)栠z傳易感分枝桿菌病篩查方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、第一部分孟德?tīng)栠z傳易感分枝桿菌病篩查方法的建立
　　目的:
　　1.建立Q-RT-PCR檢測(cè)IL-12/23-IFN-γ通路完整性的功能試驗(yàn)。
　　2.建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-12RB1和IFN-γR1蛋白表達(dá)的方法。
　　方法:
　　1.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加不同濃度的BCG（空白，2.5 ug/ml,0.25ug/ml，0.0250 ug/ml，0.0025 ug/ml）刺激培養(yǎng)48h后

2、，Q-RT-PCR檢測(cè)IFN-γ的mRNA水平，用不同全血標(biāo)本重復(fù)三次。
　　2.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加BCG及不同濃度的IL-12P70（空白，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml）刺激培養(yǎng)48h后，Q-RT-PCR檢測(cè)IFN-γ的mRNA水平，用不同的全血標(biāo)本重復(fù)三次。
　　3.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加BCG及不同濃度的IFN-γ(空白，10000U/ml，5000U

3、/ml，2500U/ml，1250U/ml)刺激培養(yǎng)48h后，Q-RT-PCR檢測(cè)IL-12B mRNA的水平，用不同的全血標(biāo)本重復(fù)三次。
　　4.提取正常人的PBMC，于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中用PHA(5ug/ml)分別刺激培養(yǎng)24，48h和88h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-12RB1和IFN-γR1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.檢測(cè)IL-12/23-IFN-γ軸完整性的功能試驗(yàn)的最佳刺激條件如下:
　　1

4、)無(wú)刺激組;2）只加BCG（0.25ug/ml）組;3)BCG（0.25ug/ml）+IL-12P70(20ng/ml);4)BCG(0.25ug/ml)+IFN-γ(2500U/ml)。
　　2.PHA（5ug/ml）刺激88h作為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-12RB1和IFN-γR1最佳刺激條件。
　　結(jié)論:
　　本研究初步建立了Q-RT-PCR檢測(cè)IL-12/23-IFN-γ軸完整性的功能試驗(yàn)，同時(shí)建立了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)I

5、L-12RB1和IFN-γR1蛋白表達(dá)的方法，兩種方法結(jié)合可以快速的篩查MSMD的疑似患者。
　　第二部分卡介苗接種異常反應(yīng)患兒孟德?tīng)栠z傳易感分枝桿菌病的篩查
　　目的:
　　對(duì)卡介苗接種異常反應(yīng)的12例患兒進(jìn)行孟德?tīng)栠z傳易感分枝桿菌病的篩查。
　　方法:
　　1.收集整理12例卡介苗接種異常反應(yīng)患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查資料。
　　2.Q-RT-PCR檢測(cè)12例患兒IL-12/23-IFN-γ通路的完整

6、性。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)9例患兒IL-12RB1和IFN-γR1蛋白的表達(dá)。
　　4.RT-PCR/PCR直接測(cè)序分析IL12RB1和IFNGR1基因。
　　結(jié)果:
　　1.臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查
　　本組12例患兒，7男5女，均以接種卡介苗后出現(xiàn)淋巴結(jié)炎為主要就診原因，9例患兒有其他病史，7例患兒有可疑家族史。患兒平均起病年齡為6.03 m，平均篩查年齡19.77 m。目前，2例死亡（例3和例9）。

7、r>　　10例患兒淋巴結(jié)活檢結(jié)果均顯示結(jié)核。5例患兒胸部CT存在異常。
　　2.12例均進(jìn)行了IL-12/23-IFN-γ通路完整性的檢測(cè)?；純?，3，9和10存在異常。
　　3.例4和9細(xì)胞表面未檢測(cè)到IL-12RB1蛋白的表達(dá)。
　　4.例3存在IFNGR1基因突變，例10為STAT1基因突變。
　　結(jié)論:
　　接種卡介苗后出現(xiàn)局部淋巴結(jié)炎是本組患兒的主要臨床表現(xiàn)，最常見(jiàn)的部位是同側(cè)腋窩淋巴結(jié)。例3存在

8、IFNGR1基因突變，確診為MSMD。例10存在AD STAT1增強(qiáng)性突變，診斷為CMC。
　　第三部分干擾素γ受體1缺陷的臨床特征及功能、基因分析
　　目的:
　　探討1例疑似孟德?tīng)栠z傳易感分枝桿菌病(MSMD)患兒的臨床特征、檢測(cè)IL-12/23-IFN-γ通路的完整性，并進(jìn)行干擾素γ受體1(IFN-γR1)基因分析，提高兒科醫(yī)生對(duì)本病的認(rèn)識(shí)。
　　方法:
　　1.根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)及常規(guī)免疫學(xué)篩查試驗(yàn)

9、，排除常見(jiàn)原發(fā)性免疫缺陷病。
　　2.Q-RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)患兒及健康對(duì)照IL-12/23-IFN-γ通路的完整性。
　　3.通過(guò)PCR及RT-PCR直接測(cè)序分別對(duì)患兒和其父母的IFNGRI基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。
　　結(jié)果:
　　1.臨床特征:
　　患兒，女，11月，因“面色蒼白、間斷咳嗽4月，進(jìn)行性加重2天”入住我院。以貧血為主要表現(xiàn)，無(wú)出血及溶血表現(xiàn);無(wú)皮疹、骨及關(guān)節(jié)腫脹。有播散性卡介苗(BC

10、G)病。四肢長(zhǎng)骨X線及胸腹聯(lián)合CT見(jiàn)全身多發(fā)骨質(zhì)破壞。
　　2.患兒NBT，血清免疫球蛋白，淋巴細(xì)胞亞群，白細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)和CD18的檢測(cè)均正常。
　　3.患兒的全血用BCG和IFN-γ共同刺激48h后IL-12B的表達(dá)量與單獨(dú)BCG刺激后比較明顯降低，而健康對(duì)照者表達(dá)量增加。
　　4.基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒IFNGR1第6外顯子雜合缺失突變(c.818-821delTTAA，p.Asn274fsX276)，父母此位點(diǎn)正常