耐藥結核分枝桿菌基因突變熱點篩查與檢測技術平臺的建立.pdf

1、為建立一種高通量、低成本、方便快速的結核分枝桿菌耐藥相關基因突變篩查技術平臺,該研究構建了結核分枝桿菌rpoB,rpsL,embB和katG四種基因的野生型重組質粒,建立并優(yōu)化了PCR擴增條件、單鏈DNA模板的制備條件和焦磷酸測序分析的參數(shù).并應用焦磷酸測序技術平臺對臨床82例耐藥結核分枝桿菌分離株的四種基因突變熱點進行篩查分析.研究結果表明,焦磷酸測序技術平臺完全可以用于結核分枝桿菌耐藥相關基因高突變區(qū)域點突變的微測序篩查分析研究;突

2、變篩查結果表明,在耐藥的菌株中存在不同程度的突變,katG315、rpoB526、rpoB531和embB306基因位點的突變頻率與文獻報道比較相符,未篩查到rpsL43基因位點的突變,而rpsL88基因位點的突變頻率稍高于文獻報道.突變篩查還發(fā)現(xiàn)一種新的基因突變位點rpoB517 CAG→TAG,和一種新的基因突變形式embB306 ATG→AGG.研究結果提示rpoB,rpsL,embB和katG等基因的點突變是結核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥

3、性的根本原因之一.突變篩查結果對結核分枝桿菌耐藥性基因診斷方案的建立具有重要的指導意義.為建立一種適合臨床應用的結核分枝桿菌耐藥性基因診斷技術,我們根據(jù)Pyrosequencing突變篩查結果,選取了結核分枝桿菌katG315、rpoB526、rpoB531、embB306和rpsL88作為待分析基因位點,構建了以上基因位點的突變型和野生型重組質粒,建立并優(yōu)化了TDI-FP技術的實驗參數(shù)與條件.應用重組質粒作為標準對照樣品,我們對經(jīng)過焦