3D多元類器官藥物篩選芯片的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、在藥物研發(fā)過程中，細(xì)胞水平測試是不可缺少的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的孔板細(xì)胞平臺(tái)過于簡陋，只是使細(xì)胞靜態(tài)地暴露于藥物溶液中，忽略了細(xì)胞外微環(huán)境，更沒有涉及藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和消除的特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性極低，參考意義有限。微流控芯片內(nèi)單元構(gòu)件的尺度使它有可能同時(shí)容納分子，細(xì)胞，組織，甚至器官，而芯片特殊的流體精準(zhǔn)操控體系又使它能同時(shí)測量物理量，化學(xué)量和生物量，兼有體積小、消耗低、高通量等優(yōu)點(diǎn)，被視為取代孔板的理想平臺(tái)。目前已報(bào)道的用于藥物篩

2、選的微流控裝置多為將不同組織來源的細(xì)胞進(jìn)行二維串、并聯(lián)，尚未考慮藥物跨膜的過程，更沒有大量實(shí)際藥物測試數(shù)據(jù)支撐，仍處于概念階段。
　　針對于已有藥物篩選芯片的不足，依據(jù)口服藥物的吸收代謝流程，本論文設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一個(gè)立體多層(3D)，集成多種細(xì)胞屏障（多元），具有多功能的微流控類器官藥物篩選芯片，用以在體外模擬藥物經(jīng)過口服后的吸收、分布、代謝和消除的過程。芯片從上至下依次集成了結(jié)腸癌細(xì)胞系(Caco-2)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUV

3、EC)、SD大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、HUVEC、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SD大鼠心臟、肺、脂肪組織和透析膜，此排列順序依照藥物在腸道被腸上皮絨毛吸收后，穿過毛細(xì)血管進(jìn)入血液，由肝門靜脈匯入肝臟，經(jīng)心臟輸送至全身，跨出毛細(xì)血管到達(dá)各個(gè)組織，最后經(jīng)腎臟排出的過程而設(shè)置。
　　論文第一部分描述了芯片的設(shè)計(jì)及構(gòu)建，并對可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。首先，分別考察了3D多元類器官芯片中各生物單元的功能。其次，利用熒光素鈉、普萘洛爾和葡聚糖的透過實(shí)驗(yàn)，確立

4、了Caco-2和HUVEC細(xì)胞層的功能性以及芯片的密封性。隨后，利用環(huán)磷酰胺驗(yàn)證了SD大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞層的代謝能力。最后，通過染色鑒定了芯片中心臟、肺和脂肪組織的活性維持。
　　第二部分描述了3D多元類器官芯片在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。包括普萘洛爾和戊巴比妥在心臟、肺和脂肪組織中的分布;環(huán)磷酰胺，紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B對MCF-7細(xì)胞的抑制作用;對乙酰氨基酚、普萘洛爾、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B引發(fā)的肝細(xì)胞損傷;

5、普萘洛爾、硫噴妥鈉、戊巴比妥和埃博霉素B在循環(huán)培養(yǎng)液中的濃度變化。多種經(jīng)典藥物的芯片測試結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相同的趨勢物，由此證明，相對于傳統(tǒng)細(xì)胞平臺(tái)，此基于微流控技術(shù)的多元3D芯片更適合于前期藥物篩選，其測試結(jié)果對隨后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有一定的參考價(jià)值，可能有效提高藥物篩選的效率。
　　第三部分對在3D多元類器官芯片測試中展現(xiàn)出優(yōu)秀抗腫瘤藥效的埃博霉素B的作用機(jī)制作了進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，作為微管蛋白穩(wěn)定劑的埃博霉素B衍生

6、物UTD1，在不同濃度下可使MCF-7和HT29細(xì)胞產(chǎn)生不同的狀態(tài):高濃度(800 nM)的UTD1能阻止有絲分裂，使細(xì)胞停滯于G2/M期，此時(shí)p21和Bax蛋白水平無顯著變換，但P53蛋白水平上調(diào)，且定位于細(xì)胞質(zhì)中，caspase7酶原被激活，證明此時(shí)細(xì)胞凋亡機(jī)制啟動(dòng);而在較低濃度(50 nM)時(shí)，UTD1誘導(dǎo)MCF-7和HT29細(xì)胞形成非整倍體并產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，細(xì)胞中檢測到p21蛋白水平上調(diào)，而Bax和P53蛋白水平

7、無顯著變化，但P53蛋白轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，說明P53轉(zhuǎn)錄活性提高并不依賴于蛋白水平的積累;P53蛋白在相同藥物帶來的不同細(xì)胞壓力下發(fā)揮出截然相反的作用，促進(jìn)被阻滯于G2/M期的細(xì)胞凋亡，而嘗試維持被阻滯于G0/G1期的細(xì)胞存活，這對于癌癥的治療可能不利。
　　本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建的微流控3D多元類器官藥物篩選芯片，可用以在體外測試藥物的ADME特性、肝細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性試驗(yàn)，其結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有相同趨勢的結(jié)果，完全優(yōu)于現(xiàn)有的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，