抗鈉-鈣交換體α-2(840-877)單克隆抗體對(duì)大鼠心肌主要離子電流的影響及其對(duì)缺血-再灌注誘發(fā)心律失常的抑制作用研究.pdf

1、目的：
　　1.制備抗鈉-鈣交換體（Na+-Ca2+exchanger， NCX）α-2重復(fù)序列（840-877）（α-2(840-877)）單克隆抗體，觀察其對(duì)成年大鼠心室肌細(xì)胞主要離子電流的影響。
　　2.建立大鼠心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）誘發(fā)的心律失常模型，觀察抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體對(duì)模型大鼠心律失常的影響，并分析其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1

2、.抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)。
　　單克隆雜交瘤細(xì)胞株由NCXα-2第840-877位氨基酸殘基肽段免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合而成，經(jīng)篩選所得的陽(yáng)性克隆株及三次亞克隆后獲得可以穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備腹水，應(yīng)用Protein A親和柱對(duì)所得腹水進(jìn)行純化，得到單克隆抗體。利用間接ELISA法檢測(cè)純化后的單克隆抗體效價(jià)；SDS-PAGE法測(cè)定

3、純化后的單克隆抗體純度。
　　2.大鼠心室肌細(xì)胞急性分離。
　　正常成年SD大鼠用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，快速開胸取心臟，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，以100％氧氣充灌的無(wú)鈣臺(tái)氏液恒壓（7.35 Kpa）、恒溫（37℃）灌流心臟10 min，改為酶液循環(huán)灌流15~20 min，待心室變大，變軟后剪取心室肌組織置于KB液中剪碎，玻璃吸管輕輕吹打3~5 min后，過(guò)濾得到單個(gè)

4、細(xì)胞，保存于KB液中，室溫下靜置3 h讓其穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　3.全細(xì)胞膜片鉗記錄。
　　應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞Na+/Ca2+交換電流（INa/Ca），L-型鈣電流（ICa-L），內(nèi)向整流鉀電流（IK1），瞬時(shí)外向鉀電流（Ito），鈉電流（INa）。
　　4.大鼠離體和在體缺血/再灌注（I/R）誘發(fā)心律失常模型的建立。
　　(1)大鼠離體缺血/再灌注誘發(fā)心律失常模型。

5、>　　SD大鼠用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸離體心臟后，懸掛于Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流，記錄心電圖，待心臟收縮穩(wěn)定后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成局部缺血30 min，松扎后再灌注30 min。分別累計(jì)缺血后30 min和再灌注后30 min內(nèi)期前收縮個(gè)數(shù)，室速的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間，室顫的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間。
　　(2)大鼠在體心臟缺血/再灌注誘發(fā)心律失常模型。
　　SD大鼠用10%水合

6、氯醛（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，開胸，采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，結(jié)扎冠脈左前降支，局部缺血15 min，松扎后再灌注15 min。抗NCXα-2(840-877)-2D2抗體、抗NCXα-2(840-877)-3F10抗體（50μg·kg-1），利多卡因（Lidocaine，7.5 mg·kg-1）分別于缺血前或再灌注前3 min尾靜脈注射，觀察期前收縮個(gè)數(shù)、室速的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間，室顫的發(fā)生率、

7、持續(xù)時(shí)間。
　　5.心肌細(xì)胞鈣瞬變測(cè)定。
　　將酶解法分離好的成年大鼠心室肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，負(fù)載5μmol·L-1熒光染料Fura2-AM，避光孵育30 min，重復(fù)清洗三次。離子影像分析系統(tǒng)儀器預(yù)熱后，將負(fù)載有熒光染料的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，在細(xì)胞槽內(nèi)貼壁10 min，用臺(tái)氏液持續(xù)灌流，流速約1~2 ml·min-1，用10 V電壓以0.5 Hz頻率給予場(chǎng)刺激觸發(fā)細(xì)胞收縮，在高倍鏡下選取紋理清晰，隨刺激穩(wěn)定收縮的心室肌細(xì)胞作

8、為觀察對(duì)象，應(yīng)用離子影像分析系統(tǒng)記錄鈣瞬變。
　　結(jié)果：
　　1.抗NCXα-2(840-877)單克隆雜交瘤細(xì)胞株篩查及建立。
　　ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)陽(yáng)性克隆篩選及連續(xù)三次亞克隆后，最終獲得能穩(wěn)定分泌抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體的2株雜交瘤細(xì)胞，并將其分別命名為＃2D2，#3F10。
　　2.抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體效價(jià)及純度檢測(cè)。
　　純化所得

9、的兩株抗體根據(jù)兩株雜交瘤細(xì)胞的克隆號(hào)命名為抗NCXα-2(840-877)-2D2（以下簡(jiǎn)稱2D2），抗NCXα-2(840-877)-3F10（以下簡(jiǎn)稱3F10）。
　　(1)純化后的2D2抗體效價(jià)為1:81920，親和常數(shù)9.33E+08；SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，2D2抗體在聚丙酰胺凝膠電泳時(shí)僅出現(xiàn)清晰的兩條帶，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品一致，純化后的2D2抗體濃度為3.21 mg·ml-1。
　　(2)純化后的3F10抗體效

10、價(jià)為1:40960，親和常數(shù)3.8E+09。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，3F10抗體在電泳時(shí)也僅出現(xiàn)清晰的兩條帶，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品一致，純化后的3F10抗體濃度為1.62 mg·ml-1。
　　3.抗NCXα-2(840-877)-3F10單克隆抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞INa/Ca的影響。
　　INa/Ca測(cè)定在電壓鉗模式下進(jìn)行。在本組之前的研究中已證實(shí)，2D2抗體對(duì)INa/Ca具有特異性抑制作用。本研究結(jié)果顯示，5~40μ

11、g·ml-1的3F10抗體對(duì)INa/Ca呈劑量依賴性的抑制作用（P<0.05），在鉗制電位為+50 mV，-100 mV時(shí)，其抑制外向內(nèi)向鈉-鈣交換電流的IC50分別為11.15和11.69μg·ml-1，最大抑制率分別達(dá)到61%，62%。
　　4.抗NCXα-2(840-877)-3F10單克隆抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞ICa-L的影響。
　　結(jié)果顯示，在5~40μg·ml-1濃度范圍內(nèi)，3F10抗體能使鈣電流密度減小，表現(xiàn)

12、出抑制作用（P<0.05）。
　　5.抗NCXα-2(840-877)-3F10單克隆抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IK1、Ito、INa的影響。
　　在5~40μg·ml-1濃度范圍內(nèi)，3F10抗體對(duì)成年大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流（IK1），瞬時(shí)外向鉀電流（Ito），鈉電流（INa）均沒(méi)有明顯作用。
　　6.抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注誘發(fā)心律失常的抑制作用。
　　(1)10μg

13、·ml-1的2D2、3F10抗體可明顯抑制大鼠離體心臟缺血性心律失常的發(fā)生，在I/R組，100%大鼠發(fā)生室速，77.78%大鼠出現(xiàn)室顫，在缺血前5 min給予2D2、3F10抗體干預(yù)后，大鼠的室速發(fā)生率分別下降至22.2%和25%，室速、室顫的持續(xù)時(shí)間也有明顯的縮短（P<0.05）。
　　(2)10μg·ml-1的2D2、3F10抗體可明顯抑制大鼠離體心臟再灌注性心律失常的發(fā)生，在I/R組再灌注期間，100%大鼠發(fā)生室速，88.8

14、9%大鼠出現(xiàn)室顫，在再灌注前5 min給予2D2、3F10抗體干預(yù)后，大鼠的室速發(fā)生率分別下降至20.09%和44.43%，室速、室顫的持續(xù)時(shí)間也有明顯的減少（P<0.05）。
　　(3)在缺血前3 min給予50μg·kg-12D2、3F10抗體預(yù)處理后，可明顯減少大鼠在體缺血性心律失常的發(fā)生。與缺血模型組相比，室速和室顫的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間以及室早的數(shù)目均明顯減少（P<0.05），其中2D2抗體抗心律失常的效應(yīng)與利多卡因更為相似

15、。
　　(4)在再灌注前3 min給予50μg·kg-12D2、3F10抗體預(yù)處理后，可明顯降低在體大鼠再灌注期室早的個(gè)數(shù)、室速的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，室顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間（P<0.05）。其中2D2抗體對(duì)再灌注性心律失常的作用與陽(yáng)性對(duì)照組利多卡因效果相似。
　　7.抗NCXα-2(840-877)單克隆抗體對(duì)大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響。
　　在5~40μg·ml-1濃度范圍內(nèi)，2D2、3F10抗體均能顯著抑制正常大

16、鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變幅度，并呈劑量依賴性抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.利用人工合成的NCXα-2(840-877)肽段作為抗原，成功制備并純化獲得兩株高效價(jià)NCX單克隆抗體2D2、3F10。
　　2.在5~40μg·ml-1濃度范圍內(nèi)，2D2抗體對(duì)鈉-鈣交換電流表現(xiàn)出特異性的抑制作用。3F10抗體對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉-鈣交換電流和L-型鈣電流均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，對(duì)內(nèi)向整流鉀電流、鈉電流、瞬時(shí)外向鉀電流均無(wú)明顯