鉛對大鼠海馬神經(jīng)元鈉電流的抑制作用

1、鉛對大鼠海馬神經(jīng)元鈉電流的抑制作用杜正清，孟紫強（山西大學環(huán)境醫(yī)學與毒理學研究所，山西太原０３０００６）摘要：目的鉛對神經(jīng)系統(tǒng)有損害作用，鈉通道是神經(jīng)元產(chǎn)生和傳遞電信號的重要樞紐，故研究鉛對大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元鈉電流（ＩＮａ）的影響。方法全細胞膜片鉗技術(shù)。結(jié)果醋酸鉛可濃度依賴地抑制ＩＮａ，１，１０，５０和１００μｍｏｌＬ－１醋酸鉛對ＩＮａ的抑制率分別為（８２０８）％，（２０９２６）％，（５１８４８）％和（６６４５７）％。此外，它還與

2、電壓呈依賴關(guān)系，５０μｍｏｌＬ－１醋酸鉛可使ＩＮａ的激活曲線顯著右移，但不改變斜率因子，還可使ＩＮａ的失活曲線顯著左移。結(jié)論鉛可抑制ＩＮａ的激活過程，可促進ＩＮａ的失活過程。鉛改變了細胞膜的電壓感應(yīng)，這可能是鉛損傷海馬神經(jīng)元的作用機制之一。關(guān)鍵詞：海馬；神經(jīng)元；膜片鉗技術(shù)，全細胞；鉛；鈉通道中圖分類號：Ｒ９９５文獻標識碼：Ａ文章編號：１０００３００２（２００４）０１００６２０４鉛是環(huán)境中的一種有毒重金屬，可通過多種途徑進入人體，對

3、人體造成多系統(tǒng)、多功能的損害。大量的研究表明，鉛可對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用［１］。阮迪云等［２］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鉛處理組大鼠海馬齒狀回興奮性突觸后電位和群峰電位誘導(dǎo)的長時程突觸后電位增強的幅度均明顯低于對照組，同時齒狀回的雙脈沖易化反應(yīng)也受到損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，鉛可對心臟產(chǎn)生損傷作用。王桂蘭等［３］報道，ＳＤ雄性大鼠每天用１０，３０，９０ｍｇｋｇ－１醋酸鉛ｉｇ９周，結(jié)果心臟細胞膜Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰ酶、超氧化物歧化酶活性收稿日期：２００３

4、０４０２接受日期：２００３０６１６基金項目：國家自然科學基金資助項目（３０２３０３１０）作者簡介：杜正清（１９７１－），女，山西大學環(huán)境醫(yī)學與毒理學研究所博士研究生，山西財經(jīng)大學講師，研究方向為環(huán)境醫(yī)學與毒理學聯(lián)系作者Ｅｍａｉｌ：ｚｑｍｅｎｇ＠ｓｘｕｅｄｕｃｎＴｅｌ／Ｆａｘ：８６３５１７０１１８９５降低，丙二醛含量、Ｃａ２＋ＡＴＰ酶活性升高，血鉛和尿鉛含量也增高。鉛能抑制機體的體液免疫和細胞免疫功能［４］。戴曉青等［５］

5、報道了鉛對背根神經(jīng)元鈉通道和鉀通道的影響，然而鉛對海馬神經(jīng)元鈉通道的影響還未見報道。為此，本文利用全細胞膜片鉗技術(shù)研究了鉛對大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元鈉離子通道的影響，以探討鉛對神經(jīng)細胞毒性作用的機制。１材料與方法１１動物Ｗｉｓｔａｒ大鼠，鼠齡５～１０ｄ，♀♂不限，中國輻射防護研究院動物房提供。１２試劑蛋白酶，ＨＥＰＥＳ，ＥＧＴＡ，Ｎａ２ＡＴＰ和醋酸鉛〔Ｐｂ（Ａｃ）２３Ｈ２Ｏ〕均為Ｓｉｇｍａ公司產(chǎn)品。標準細胞外液（ｍｍｏｌＬ－１）：ＮａＣｌ

6、１５０，ＫＣｌ５，ＭｇＣｌ２１１，ＣａＣｌ２２６，ＨＥＰＥＳ１０，葡萄糖１０，ｐＨ７４，記錄前加入ＣｄＣｌ２０２ｍｍｏｌＬ－１。電極內(nèi)液（ｍｍｏｌＬ－１）：ＣｓＣｌ７５，ＮａＦ７５，ＭｇＣｌ２２，ＨＥＰＥＳ１０，ＥＧＴＡ２５，Ｎａ２ＡＴＰ３，ｐＨ７５。１３大鼠海馬神經(jīng)元錐體細胞的急性分離大鼠斷頭取腦，置于０～４℃孵育液中分出海馬，切成４００～５００μｍ厚的腦片，置于３２℃孵育液中，連續(xù)通入Ｏ２，孵育３０ｍｉｎ。而后加入蛋白酶，使其終濃度

7、為０５ｇＬ－１，３２℃下消化３５ｍｉｎ。消化畢用孵育液洗腦片３次，投入盛有氧飽和標準細胞外液的離心管內(nèi)，用Ｐａｓｔｅｕｒ吸管輕輕吹打，制成單細胞懸液，靜置５ｍｉｎ。取上部細胞懸液，加入盛有氧飽和標準細胞外液的培養(yǎng)皿內(nèi)，１５ｍｉｎ后細胞貼壁，即可進入全細胞膜片鉗記錄［６］。１４全細胞膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)分析在２０～２５℃室溫下，利用Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ膜片鉗放大器（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＵＳＡ）進行全細胞膜片鉗記錄，記錄電極由玻璃

8、毛細管徑ＰＰ８３０型微電極拉制儀（Ｎａｒｒｉｓｈａｇｅ，Ｊａｐａｎ）拉制，充灌電極內(nèi)液后阻抗為２６中國藥理學與毒理學雜志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００４年２月；２００４Ｆｅｂ；１８（１）：６２－６５１８（１）：６２－６５Ｆｉｇ３Ｅｆｆｅｃｔｏｆ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ｏｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＩＮａｉｎｈｉｐｐｏｃ

9、ａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆｒａｔｓ（Ａ）ＩＮａｗａｓｅｖｏｋｅｄｂｙ１２ｍｓｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇｐｕｌｓｅｓｆｒｏｍＨＰｏｆ－１００ｍＶｔｏ０ｍＶｉｎ１０ｍＶｓｔｅｐｓａｐｐｌｉｅｄａｔａｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ０２５ＨｚＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅｆｉｔｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＢｏｌｔｚｍａｎｎｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｍ：Ｇ／Ｇｍａｘ＝１／｛１＋ｅｘｐ〔（Ｖ－Ｖｈ）／ｋ〕｝，ｗｈｅｒｅＧｍａｘｉｓｔｈｅｍａｘｉｍ

10、ａｌｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ，Ｖｈ，ｔｈｅｖｏｌｔａｇｅａｔｗｈｉｃｈｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓｈａｌｆａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｎｄｋｉｓｔｈｅｓｌｏｐｅｆａｃｔｏｒｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇｔｈｅｓｌｏｐｅｏｆｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓＢｅｆｏｒｅＰｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（４２００６）ｍＶａｎｄ９００６，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＤｕｒｉｎｇ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈ

11、ａｎｄｋｗｅｒｅ－（３６１０５）ｍＶａｎｄ７２０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｂ）Ｃｕｒｒｅｎｔｓｗｅｒｅｅｌｉｃｉｔｅｄｂｙａｔｗｏｐｕｌｓｅｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａ５００ｍｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｅｐｕｌｓｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ（ｆｒｏｍ－１２０ｍＶｔｏ０ｍＶ）ｗａｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａ１２ｍｓｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇｐｕｌｓｅｆｒｏｍ－１００ｍｓｔｏ－３０ｍＶａｐｐｌｉｅｄａｔａｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ

12、０２５ＨｚＨＰ＝－１００ｍＶＳｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅｆｉｔｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＢｏｌｔｚｍａｎｎｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｍ：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／｛１＋ｅｘｐ〔（Ｖ－Ｖｈ）／ｋ〕｝，ｗｈｅｒｅＩｍａｘｉｓｔｈｅｍａｘｉｍａｌｃｕｒｒｅｎｔ，Ｖｈ，ｔｈｅｖｏｌｔａｇｅａｔｗｈｉｃｈｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓｈａｌｆｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｎｄｋｉｓｔｈｅｓｌｏｐｅｆａｃｔｏｒｄｅｓｃ

13、ｒｉｂｉｎｇｔｈｅｓｌｏｐｅｏｆｔｈｅｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓＢｅｆｏｒｅＰｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（５４１０３）ｍＶａｎｄ６８０２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＤｕｒｉｎｇ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（５８３０５）ｍＶａｎｄ９８０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ珋ｘｓ，ｎ＝１０－（５８３０５）ｍＶ（ｎ＝１０，Ｐ＜００５），ｋ

14、分別為６８０２和９８０５（ｎ＝１０，Ｐ＜００５）。由此可見，醋酸鉛可使ＩＮａ的失活曲線顯著左移，且改變其斜率因子。３討論神經(jīng)細胞膜電壓門控性鈉通道在神經(jīng)元的信號調(diào)控過程中具有十分重要的作用，同時它又是某些神經(jīng)毒素作用的靶點，這些毒素通過影響鈉通道的結(jié)構(gòu)和功能而發(fā)揮其對中樞神經(jīng)元的損傷效應(yīng)［５～７］。當去極化刺激時，電壓門控鈉通道開啟所形成的內(nèi)向ＩＮａ是產(chǎn)生神經(jīng)動作電位上升相的必要條件和關(guān)鍵因素，因此，ＩＮａ的幅度是產(chǎn)生神經(jīng)信號的關(guān)鍵。本

15、實驗證實了鉛降低ＩＮａ的幅度，抑制ＩＮａ的激活過程，促進ＩＮａ的失活化過程。說明了鉛損傷了神經(jīng)信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過程，這一過程在鉛抑制神經(jīng)細胞鈣離子通道和鉀離子通道，從而對神經(jīng)細胞產(chǎn)生損傷作用中起著一種輔助效應(yīng)。另外，電壓依賴性ＩＮａ的減小，會造成神經(jīng)元胞內(nèi)Ｃａ２＋濃度降低，從而抑制Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰ酶的活性，使得細胞難以超極化，不利于恢復(fù)到靜息電位。它會影響胞內(nèi)Ｋ＋濃度，加速能量的消耗［８］。胞內(nèi)正常水平的Ｋ＋濃度可抑制引起半胱天冬酶

16、３效應(yīng)的蛋白酶的激活和凋亡的ＤＮＡ斷裂；而胞內(nèi)Ｋ＋濃度的減小可激活半胱天冬酶和核酸酶，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［９］。另一方面，能量消耗的加速導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，使Ｃａ２＋ＡＴＰ酶的活性降低，Ｃａ２＋外流減小，由此引起鈣平衡機制的破壞，造成胞內(nèi)Ｃａ２＋水平持續(xù)增高，導(dǎo)致蛋白酶、磷脂酶和核酸內(nèi)切酶活化，引起蛋白質(zhì)、磷脂和ＤＮＡ損傷，而且還會啟動耗能代償機制，導(dǎo)致與功能有關(guān)的系統(tǒng)紊亂［１０］。本研究結(jié)果表明，鉛可抑制大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元的ＩＮａ

17、的激活過程，促進其失活過程，使胞內(nèi)的鈉離子濃度減小。分子的活動是電壓門控通道的基本特征，在膜去極化時，會有快速激活的ＩＮａ產(chǎn)生；ＩＮａ的激活推遲可能是鉛快速且具有高度選擇性地進入離子通道，結(jié)合跨膜蛋白氨基酸殘基，在空間位置上關(guān)閉電壓傳感器來影響門控電荷，從而誘導(dǎo)非正常狀態(tài)下的離子通道構(gòu)象，從而影響鈉內(nèi)流。鉛促使鈉離子通道失活可能是鉛結(jié)合氨基末端的離子通道蛋白，通過另一條氨基酸片段栓在通道的余留部分，進而使通道提前失活。鉛的這一影響會使膜