鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束中木質(zhì)纖維素酶特性分析及其純化研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是世界上分布最廣的一種有機(jī)化合物，因?yàn)樗慕到庑屎艿停猿蔀槿蛱佳h(huán)過程的一個(gè)限制因素。木質(zhì)纖維素酶的生產(chǎn)和純化過程也十分緩慢并且產(chǎn)量不高，對于木質(zhì)纖維素這種逐年增加的“廢棄能源”來說，情況不容樂觀，逆膠束萃取法被證明是對于酶的萃取純化非常有效的方法之一。而逆膠束是通過表面活性劑的極性端和非極性端把水相和有機(jī)相結(jié)合起來的乳化結(jié)構(gòu)。由表面活性劑包裹起來的水核能夠增溶水溶性酶和其他的極性物質(zhì)，這使得逆膠束萃取法成為了一種相對

2、完美的液液生物萃取方法。而且，逆膠束的水核是在納米級(jí)別的尺寸，使得增溶進(jìn)入水核的酶能夠保持較高和穩(wěn)定的活性，對于酶萃取來說是個(gè)良性優(yōu)越的環(huán)境。一般來說，逆膠束萃取主要包括兩個(gè)步驟，前萃和后萃，目前大多數(shù)的學(xué)者更多的關(guān)注前萃過程，因?yàn)楹筝瓦^程的進(jìn)行相對來說較難，但是后萃過程也至關(guān)重要，因?yàn)檫@直接關(guān)系到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。
　　目前，大量的國內(nèi)和國際的研究學(xué)者都在進(jìn)行逆膠束萃取的研究，但是大多用的是化學(xué)表面活性劑來構(gòu)建逆膠束體系。這種表面

3、活性劑的來源相對有限，需要繁雜的工業(yè)生產(chǎn)，并且會(huì)給環(huán)境帶來大量的化工垃圾，而且有時(shí)候他們能夠使體系中的酶失活，降低酶萃取的效率。相對來說，目前越來越多人開始關(guān)注生物表面活性劑，因?yàn)樗旧淼目山到庑院偷投拘裕瑫r(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)體系物質(zhì)的重復(fù)利用，而且由生物表面活性劑構(gòu)建的逆膠束體系相對于化學(xué)表面活性劑來說，具有更好的增溶特性，不錯(cuò)的環(huán)境相容性和相對溫和的反應(yīng)環(huán)境。目前，針對生物表面活性劑的研究都進(jìn)展的非常順利，尤其是廣泛使用的鼠李糖脂。

4、　　在第一部分的研究中，對比三種化學(xué)表面活性劑(CTAB，AOT and Tween-80)，研究了在正己醇/異辛烷(1∶1，v/v)溶劑中，由鼠李糖脂構(gòu)建的逆膠束中水核的性質(zhì)還有其微環(huán)境的行為狀況。在這一部分的研究過程中，我們構(gòu)建了表面活性劑/正己醇/異辛烷/水逆膠束體系的三相圖，來了解在不同表面活性劑，不同組分比例情況下，體系中三種相之間的區(qū)域大小變化。同時(shí)利用紅外光譜儀在波段3050-3750 cm-1區(qū)域測了-OH基的紅外振動(dòng)情

5、況，通過對于紅外光譜的分析來了解逆膠束水核中水的分布狀態(tài)，結(jié)合水和自由水的組成與水核大小的關(guān)系等等。而且也通過熒光法，測量了鼠李糖脂在逆膠束體系中的臨界膠束濃度為0.055 mM·L-1，表明即使很少劑量的鼠李糖脂也能形成逆膠束。另外，本實(shí)驗(yàn)還測了逆膠束體系的電導(dǎo)特性，可以看出體系的含水率在35.1處，電導(dǎo)發(fā)生了突變，這個(gè)數(shù)值比其他的化學(xué)表面活性劑的高，說明系統(tǒng)能夠增溶更多的水。最后，還檢測了逆膠束水核的尺寸，我們發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂能夠大量的

6、提高逆膠束的增溶水能力，形成較大的膠束水核，從而為酶促反應(yīng)提供較好的微環(huán)境。
　　第二部分的研究，檢測了以愈創(chuàng)木酚為底物的漆酶在逆膠束體系中的酶活變化，主要通過紫外可見分光光度法來測得漆酶酶活。含水率對于酶活的影響主要呈現(xiàn)一個(gè)鐘鼎狀，先增大后減小，在ω0=19處取得酶活的最大。當(dāng)水相的pH=5.2，[KCl]=0.05 mol·L-1，鼠李糖脂逆膠束體系漆酶活性能夠達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。另外，我們考察了不同介質(zhì)對于漆酶降解的動(dòng)力過程的影響

7、，在逆膠束中酶活沒有在水介質(zhì)中高，但是在逆膠束體系中，鼠李糖脂逆膠束相對于其他化學(xué)表面活性劑依然有著較高的漆酶酶活，在鼠李糖脂濃度為0.055 mM/L取得酶活最大值。
　　在鼠李糖脂逆膠束體系中對于纖維素酶和LiP酶進(jìn)行前萃過程的萃取，考察了體系中的萃取時(shí)間，pH，表面活性劑濃度和離子強(qiáng)度、種類對于萃取效果的影響，纖維素酶和LiP酶分別有各自萃取的優(yōu)化條件。LiP:[RL]=50 CMC，[KCl]=40 mmol/L，pH值為

8、3.0，振蕩時(shí)間為30 min，在KCl中有最高萃取效率;纖維素酶:[RL]=40 CMC，[KCl]=50 mmol/L，pH值為3.5，振蕩時(shí)間為30 min，在NaCl中有最高萃取效率。
　　在后萃過程中，接著前萃過程產(chǎn)生的萃余油相繼續(xù)將溶解在其中的酶分離出來到水相當(dāng)中，同樣地，考察了萃取時(shí)間，pH，離子強(qiáng)度和種類以及外加溶劑對于后萃萃取效果的影響，在該后萃中兩種酶分別有各自后萃的相對最優(yōu)狀況。LiP:[KCl]=0.5 m

9、ol/L，pH值為7.0，振蕩時(shí)間為30 min，乙醇體積比為8％，在KCl中有最高萃取效率;纖維素酶:[KCl]=0.15 mol/L，pH值為7.0，振蕩時(shí)間為40 min，乙醇體系比為4％，在NaC1中有最高萃取效率。通過后萃過程的研究發(fā)現(xiàn)，外加醇類可以明顯的提高系統(tǒng)的酶活回收率，萃取率和純化倍數(shù)，并且能夠使得萃取過程更快更好。
　　總的來說，對于鼠李糖脂構(gòu)建的逆膠束體系來說，它能夠?yàn)槊复俜磻?yīng)和酶的液液純化萃取（包括前萃和后