PGD-HLA分型方法MDA-PCR-SBT的建立.pdf

1、目的：第一部分：進(jìn)一步完善本中心初步建立的多重置換擴(kuò)增(multipledisplacement amplification，MDA)全基因組擴(kuò)增方法，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高M(jìn)DA擴(kuò)增單個(gè)/兩個(gè)卵裂球的成功率。為對(duì)植入前胚胎進(jìn)行HLA配型(PGD/HLA-genotyping)打下基礎(chǔ)。第二部分：在本中心建立對(duì)植入前胚胎的HLA分型方法-對(duì)單個(gè)/兩個(gè)卵裂球MDA產(chǎn)物采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction，

2、PCR)擴(kuò)增HLA-DR、DQ的第二外顯子，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序分型(sequencing-based typing，SBT)，我們稱(chēng)之為MDA-PCR-SBT分型方法。
　　 方法：第一部分：我們首先通過(guò)顯微操作活檢D3胚胎得到1～2個(gè)卵裂球細(xì)胞。采用多重置換擴(kuò)增(MDA)方法：在30℃恒溫條件下，phi29 DNA聚合酶在核苷酸六聚體隨機(jī)引物與模板結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)開(kāi)始同時(shí)復(fù)制，形成級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，最終生成高拷貝量?jī)?yōu)質(zhì)的模板DN

3、A。第二部分：隨機(jī)選取了9對(duì)自愿捐獻(xiàn)外周血和廢棄胚胎的夫婦，取D3廢棄1PN、2PN、3PN受精胚胎，取廢棄胚胎的單個(gè)/兩個(gè)卵裂球細(xì)胞，采用MDA行全基因組擴(kuò)增，對(duì)單個(gè)/兩個(gè)卵裂球MDA產(chǎn)物采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增HLA-DR、DQ的第二外顯子，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序分型(sequencing-based typing，SBT)，雙向測(cè)序，獲得胚胎的HLA基因型；提取其父母外周

4、血基因組DNA，采用同樣的直接測(cè)序分型方法確定父母HIA基因型；然后比較父母與胚胎之間HLA基因型，確定9個(gè)家庭成員各自的HLA單倍型及其遺傳關(guān)系，并在廢棄胚胎之間進(jìn)行HLA配型。
　　 結(jié)果：第一部分：本研究共收集D3天卵裂期廢棄胚胎126個(gè)，在每個(gè)胚胎中選取1～2個(gè)卵裂球置于同一PCR管中。隨機(jī)分為兩組：?jiǎn)蝹€(gè)卵裂球組、兩個(gè)卵裂球組。單個(gè)卵裂球組50個(gè)胚胎，MDA擴(kuò)增成功46個(gè)，擴(kuò)增成功率92％，2個(gè)卵裂球組76個(gè)胚胎，MDA

5、成功擴(kuò)增73個(gè)，擴(kuò)增成功率96.1％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(x2=0.944，P>0.05)，兩者M(jìn)DA擴(kuò)增成功率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示多重置換擴(kuò)增方法擴(kuò)增單/兩個(gè)卵裂球成功率高，可以用于單/兩個(gè)卵裂球細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增，為本中心植入前胚胎進(jìn)行基因病診斷、HLA配型奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 第二部分：取9對(duì)夫婦經(jīng)IVF-ET后剩余廢棄胚胎，共76個(gè)分為兩組：?jiǎn)温蚜亚蚪M36個(gè)胚胎，兩個(gè)卵裂球組40個(gè)胚胎。單卵裂球組擴(kuò)增成功率為94.1％；兩

6、個(gè)卵裂球組擴(kuò)增成功率為100％。共有74個(gè)胚胎MDA擴(kuò)增成功。對(duì)74個(gè)胚胎MDA產(chǎn)物行PCR-SBT檢測(cè)，測(cè)序陽(yáng)性率為100％。單卵裂球組MDA產(chǎn)物測(cè)序陽(yáng)性率為100％，DQ等位基因脫扣率為1.5％，DR等位基因脫扣率為0。兩個(gè)卵裂球組MDA產(chǎn)物測(cè)序陽(yáng)性率為100％，DQ等位基因脫扣率為0，DR等位基因脫扣率為0。胚胎HLA單倍體重新組合率為20.2％(30/148)。廢棄胚胎之間HLA配型一致的比例為20.3％(15/74)。比理論值

7、25％略低，可能與本實(shí)驗(yàn)使用分級(jí)差、異常受精胚胎有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.進(jìn)一步完善了本中心初步建立的多重置換擴(kuò)增(multiple displacementamplification，MDA)全基因組擴(kuò)增方法，進(jìn)一步優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，將MDA擴(kuò)增單個(gè)/兩個(gè)卵裂球的成功率提高到94％以上。MDA方法的建立為本中心植入前胚胎進(jìn)行基因病診斷、HLA分型(PGD/HLA-genotyping)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　

8、 2.我們成功建立了PGD/HLA分型方法MDA-PCR-SBT，為開(kāi)展植入前胚胎HLA配型聯(lián)合或不聯(lián)合基因遺傳病的PGD檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。在體外受精的胚胎中選擇與患兒HLA基因型一致且正常的純合子(不攜帶致病基因)或者雜合子(攜帶隱性致病基因)胚胎移植，創(chuàng)造一個(gè)救助者同胞(SaviourChild，SC)，分娩時(shí)使用健康SC的臍血或者骨髓用于治療需要進(jìn)行造血干細(xì)胞移植(haematopoietic stem cell transplan