2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及慢病毒載體介導siRNA對I型膠原抑制作用的研究.pdf

1、腎臟纖維化是糖尿病腎病等慢性腎臟疾病終末期的病理變化特征，其本質(zhì)是細胞外基質(zhì)的過度積聚，其中Ⅰ型膠原的過度表達在該過程中起到重要作用。利用RNA干涉技術下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過度表達，以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。
　　 第一部分2 型糖尿病腎病大鼠模型的建立
　　 目的：在原有高糖高脂飲食+鏈脲佐菌素（STZ）造模方法的基礎上進一步縮短造模時間，優(yōu)化模型，使模型更加接近于人類2 型糖尿病腎臟病，為探索其機制及治療方法提供

2、一個更好的動物模型。方法：4周的雄性SD大鼠，隨機分為對照組（A組，n=15）和模型組（B組，n=15）。A組為普通飲食，B組采用高糖高脂飼料＋5％葡萄糖飲水喂養(yǎng)，誘發(fā)胰島素抵抗，2周后，按照30mg/kg的劑量腹腔注射STZ，連續(xù)注射3天，誘發(fā)持續(xù)高糖血癥，繼續(xù)觀察6周。每2周測定大鼠的體質(zhì)量、尿蛋白及尿白蛋白排泄率、血糖，實驗及注射STZ 前、注射6周后采集血樣，測血肌酐、血尿素氮及血胰島素。結果：實驗前2組大鼠的體質(zhì)量、血糖、血胰

3、島素、血肌酐和尿素氮無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。高糖高脂飼料+5％葡萄糖飲水2周后，B組血胰島素較A組有明顯的升高（P＜0.01），完成STZ 注射24h后，B組血糖有明顯升高(P＜0.01)。其腎臟改變特點，臨床上表現(xiàn)為持續(xù)蛋白尿，病理改變?yōu)橄的ぜ毎錾⑾的^(qū)基質(zhì)增多。結論：高糖高脂飼料+5％葡萄糖飲水+連續(xù)小劑量STZ 可建立理想的2 型糖尿病腎病大鼠模型，該模型具有人類2 型糖尿病腎病的主要表型特征和相似的發(fā)病過程，且造模時間

4、相對縮短。
　　 第二部分I 型膠原慢病毒干擾載體的構建及其在糖尿病腎病大鼠腎臟轉(zhuǎn)染的研究
　　 目的：在體外構建并篩選出靶向I型膠原的有效RNA 干擾慢病毒載體，研究其在活體糖尿病腎病大鼠腎臟的基因轉(zhuǎn)染及表達情況。方法：設計3條siRNA 序列并合成雙鏈DNAoligo，制備目的基因RNA 干擾慢病毒載體，體外感染目的細胞，利用RT-PCR的方法檢測目的基因I型膠原的表達情況，從而篩選出有效的干擾靶點。經(jīng)腎動脈注射I型

5、膠原慢病毒干擾載體，在注射后第15天處死大鼠，觀察綠色熒光檢測報告基因的表達。結果：酶切鑒定及測序結果均提示siRNA 序列成功連接入載體中。RT-PCR結果提示1號靶點的干擾效率最高，達到77％左右。腎臟組織可觀察到綠色熒光。結論：I型膠原靶向RNA 干擾慢病毒載體構建成功，能有效抑制目的細胞中I型膠原的表達且有效而穩(wěn)定的將外源基因?qū)牖铙w大鼠腎臟。
　　 第三部分慢病毒載體介導siRNA對糖尿病腎病大鼠I型膠原抑制作用的研究

6、
　　 目的：分析I型膠原慢病毒干擾載體對糖尿病腎病大鼠體內(nèi)抑制I型膠原的效果；
　　 方法：14只雄性患有糖尿病腎病Sprague-Dawley大鼠隨機分為三組：A組為I型膠原慢病毒干擾載體干涉組（n=6）；B組為空病毒對照組（n=6）；C組為空白對照組（n=2）。
　　 利用腎動脈注射方法，每只I型膠原慢病毒干擾載體干涉組及空病毒對照組糖尿病腎病大鼠分別注射I型膠原慢病毒干擾載體、空病毒200ul、空白組注射

7、等量生理鹽水。
　　 大鼠在注射后兩周處死，取得腎臟。用熒光定量PCR和免疫組化Western blot分別檢測I型膠原mRNA和蛋白表達量的改變，驗證所設計的I型膠原慢病毒干擾載體的抑制效應。
　　 結果：與空病毒組及空白組比較， I型膠原慢病毒干擾載體組mRNA表達分別下調(diào)38-48％（P＜0.05)，蛋白表達分別下調(diào)10-22％（P＜0.05)，空病毒組與空白組比較無差別。
　　 結論：I型膠原慢病毒干擾載