慢病毒介導的肺特異性X蛋白(LUNX)siRNA轉(zhuǎn)染表達對A549肺癌株抑制作用的研究.pdf

1、作為一名肺腫瘤外科醫(yī)生，必須掌握生物腫瘤標志物和分子、基因組學的基礎知識，這樣才能把握肺癌研究領域的最新進展。肺癌的分子生物學特征呈現(xiàn)出高度的復雜性和變化的異質(zhì)性，在生物學、遺傳學、基因?qū)W、蛋白基因組學等多個學科層面上的分子機制和功能變化還尚未明確，外科醫(yī)生在這些方面的深入理解，非常有助于進一步研究肺癌的診斷方法、治療手段和預后檢測。
　　肺癌的發(fā)病機制是一個多時間點、多變化性的進展過程，可以認為肺癌仍然是一種由諸多個性化基因或者

2、基因組驅(qū)動的疾病，并非單一基因突變能夠?qū)е?，其中包括多種多樣的基因功能異常。大多數(shù)學者已經(jīng)達成共識，促癌基因和抑癌基因的改變共同貫穿了肺癌的整個進展過程，特別是促癌基因相關通路的激活和抑癌基因相關通路的失活。對這些信號通路的研究，包括肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制的研究，對于治療策略的進展至關重要。使用這些信息來指導治療的基礎是治療基因的特異性改變。例如靶向基因調(diào)控異常的分子信號及其激活的下游通路。近年來，依據(jù)新型靶向藥物以及新的腫瘤生物標記物

3、來指導臨床治療，促使腫瘤生長的特定基因改變及其提供的治療靶點在肺癌的治療中已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的臨床效果，仍然需要進一步探索新的治療靶點及其相應藥物。
　　肺癌是全世界范圍內(nèi)患病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，每年總計約有七百萬人死于肺癌及肺癌相關并發(fā)癥。隨著工業(yè)化污染和大氣污染的加劇，肺癌已經(jīng)成為中國居民中患病率和病死率上升最快的惡性腫瘤，已經(jīng)占據(jù)男性腫瘤患者死亡原因的第一位，女性腫瘤患者死亡原因的第二位，每年病死人數(shù)在六十萬以上，肺癌

4、總體病死人數(shù)占到了總體腫瘤死亡人數(shù)的22.7％。
　　從肺外科醫(yī)生的角度來看，手術治療是治療肺癌的最佳治療手段，隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，越來越多的肺小結(jié)節(jié)病灶被發(fā)現(xiàn)，肺段切除術、亞肺葉切除術、肺葉切除術治療肺結(jié)節(jié)開展的越來越廣泛，術后病理證實，其中大部分結(jié)節(jié)為惡性，而且早期非小細胞肺癌占大多數(shù)。但是中國大多數(shù)肺癌患者初次就診已經(jīng)進入中晚期，失去手術時機，即使是沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IA、IB期患者，在接受根治性切除手術后5年內(nèi)，復發(fā)率仍

5、然高達30％以上。研究表明，肺癌患者大部分存在隱匿性微轉(zhuǎn)移病灶，只是現(xiàn)有的彩超、CT、MRI，甚至PET-CT等常規(guī)臨床檢查手段無法早期發(fā)現(xiàn)。
　　肺癌的診療模式已經(jīng)進入多學科協(xié)作(MDT)模式和精準治療時代，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療、療效預測、改善預后，是新時代肺癌治療領域的最主流方向。目前肺癌的早期微轉(zhuǎn)移檢查方法集中在血液腫瘤標志物檢測方向，但是尚有許多不足之處，同時，液體活檢技術快速發(fā)展，包括血液循環(huán)腫瘤細胞、血漿游離D

6、NA和外泌體的檢測，這是蛋白質(zhì)組學、基因組學進展的臨床醫(yī)學轉(zhuǎn)化，也是肺癌進入基因治療時代的必然趨勢。腫瘤細胞分泌的外泌體越來越引起重視，這種物質(zhì)包含是一種包含腫瘤基因miRNA及其蛋白產(chǎn)物，通過與腫瘤微環(huán)境中的其他細胞相互作用，在腫瘤進展、遠處轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等方面有重要意義。
　　日本腫瘤科醫(yī)生Kyoko Iwao Koizumi通過蛋白差異顯示技術，分離出一種在人類呼吸系統(tǒng)臟器內(nèi)特有表達的蛋白一肺特異性X蛋白mRNA(LUNX

7、mRNA)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LUNX mRNA在肺癌組織、癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、前哨淋巴結(jié)、跳躍性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、肺癌轉(zhuǎn)移灶中均存在高表達，因此，證明LUNX mRNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中有重要作用，LUNX mRNA檢測是一種早期發(fā)現(xiàn)肺癌亞臨床微轉(zhuǎn)移的有效手段，LUNX mRNA也是肺癌臨床基因治療的一個潛在靶點。
　　Small interfering RNA(siRNA):是一種小RNA分子（21-25核苷酸），長度約在22n

8、t左右，由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點。SiRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補的目標mRNA的沉默。siRNA通過干擾細胞內(nèi)正在轉(zhuǎn)錄的mRNA，從而抑制個別基因的表達，進一步阻止其蛋白合成。Dicer酶將一個由能自我復制的基因序列，又稱miRNA的調(diào)控序列生成的長片段，切割成短siRNA。siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。進入細胞內(nèi)的途徑是轉(zhuǎn)

9、染表達，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并與mRNA產(chǎn)生完全互補作用。siRNA的功能是導致靶標基因的降解，是RNA干擾作用的產(chǎn)物，siRNA的原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性，在某些病毒感染人體時，能抑制病毒感染，是人體自我保護機制。然而，siRNA的設計需要仔細比對靶基因的生物信息學分析。靶標一般在CDS區(qū)選擇:siRNA的作用是在mRNA水平，而不是在蛋白質(zhì)水平。設計siRNA之前，需要進行Gene Bank庫準確檢索靶mRNA的序

10、列。某些情況下，會出現(xiàn)siRNA的無效設計，所以不是根據(jù)基因組序列，而是根據(jù)mRNA序列而來設計。
　　RNA干擾技術(RNA interference，RNA i)是通過小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)造成目的mRNA特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。RNA干擾由轉(zhuǎn)運到細胞細胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活。沉默機制可導致由小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA(shRNA)誘導實現(xiàn)靶m

11、RNA的降解，或者通過小RNA(miRNA)誘導特定mRNA翻譯的抑制。通過幾種蛋白的活性，通過短反義核酸（siRNA和shRNA序列）鎖定細胞mRNA，從而實現(xiàn)其隨后的降解。這反過來阻斷了該蛋白的進一步表達/聚集，導致其水平的下降，最終實現(xiàn)抑制作用。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界生命體中，是一種在生物進化過程中，能夠有效抵御外來基因改變原有基因結(jié)構(gòu)作用的機制，為保持生物基因組穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。RNA i可以作為一種高效的基因剔除工具，廣泛

12、應用于功能基因組學研究領域，并將逐漸進入肺癌臨床基因治療時代。
　　慢病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，作為一種載體，慢病毒表達質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)導、整合目標基因mRNA至受體染色體組DNA，并進一步達到持久性表達，慢病毒介導的RNA干擾技術安全、高效，可以達到良好的基因干擾與基因沉默效果。本次試驗研究，通過慢病毒載體介導的RNA干擾技術，以LUNX蛋白表達陽性的A549肺癌細胞（腺癌）株為研究對象，以LUNX mRNA為目的靶基因，轉(zhuǎn)染表達LUNX

13、siRNA進入肺癌細胞，并通過免疫組織化學法、Real-time PCR(RT-PCR)技術、噻唑藍(MTT)比色法、免疫酶化學法、劃痕實驗法、透射電鏡觀察等技術，研究LUNX mRNA的降低表達對細胞生物學行為的影響。此外通過檢測A549肺癌細胞株的堿性磷酸酶(AKP)、表面活性蛋白(SPC)和溴化脫氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)的表達變化，進一步分析LUNX mRNA調(diào)控A549肺癌細胞生物學功能的信號通路和分子機制。本研究旨在通過以

14、上實驗探討LUNXmRNA在肺癌早期微轉(zhuǎn)移中的作用及其機理，篩選LUNX作為新的肺癌治療靶點，檢驗其作為靶向基因治療的可能性、為肺癌的精準治療研究、新型基因治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供必要的實驗室證據(jù)。
　　目的:
　　1.1 根據(jù)LUNX編碼區(qū)基因序列，設計并合成LUNX siRNA的DNA，以慢病毒(pGCL和pHelper1.0)為載體，構(gòu)建并進行細胞轉(zhuǎn)染。
　　1.2 研究LUNX轉(zhuǎn)染表達對A549肺癌細胞株的細胞形態(tài)、

15、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學功能的影響。
　　方法:
　　2.1 應用慢病毒基因轉(zhuǎn)染表達方法檢測LUNX表達對A549肺癌細胞株的抗增殖作用和生物學功能的影響。
　　2.2 MTT實驗和細胞劃痕實驗觀察A549肺癌細胞增殖和遷移能力變化。
　　2.3 RT-PCR技術檢測A549肺癌細胞株中LUNX-siRNA的表達。
　　2.4 通過免疫組織化學法和RT-PCR技術檢測LUNX-siRNA在A549肺癌細胞株

16、中的表達水平。
　　結(jié)果:
　　3.1 利用LUNX基因確定其序列特異性，設計并合成LUNX-siRNA的DNA，退火、酶切、連接載體后進入pGCL-GFP表達質(zhì)粒?；旌蟨Helper1.0和pGCL-GFP載體，成功構(gòu)建LUNX-siRNA慢病毒載體。
　　3.2 將體外培養(yǎng)好的A549肺癌細胞株分為3組:A組:LUNX-siRNA和pGCL-GFP共轉(zhuǎn)染組，B組:未轉(zhuǎn)染組，C組:pGCL和pHelper1.0共轉(zhuǎn)染

17、組，A組為實驗組，B，C兩組為對照組。成功進行了轉(zhuǎn)染后，加入400μgPmIG419篩選，經(jīng)3周后形成陽性克隆組，擴增培養(yǎng)。
　　3.3 LUNX轉(zhuǎn)染的A549細胞株遷移能力低于正常A549細胞株(P=0.026)。
　　3.4 免疫細胞化學證實轉(zhuǎn)染后A549肺癌細胞中有LUNX穩(wěn)定表達。
　　結(jié)論:
　　4.1 成功構(gòu)建帶有靶向基因特異性小干擾RNA的慢病毒，將其感染肺癌細胞后，可有效降低目標蛋白-肺特異性Ⅹ蛋