普羅布考、西洛他唑?qū)Υ笫蠊撬柙葱詢?nèi)皮祖細胞功能活性影響的研究.pdf

1、目的：隨著研究的進展，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的治療已經(jīng)取得顯著成效，單獨使用抗氧化、調(diào)脂及抗血小板治療已取得了良好效果，尤其是普羅布考（Probucol，丙丁酚）和西洛他唑(Cilotazol)為應用廣泛的抗動脈粥樣硬化藥物，臨床主要用于改善慢性動脈閉塞癥引起的缺血性癥狀如潰瘍及間歇性跛行等。兩藥在抗動脈粥樣硬化、防治血管形成術(shù)后再狹窄等心血管疾病的治療方面已經(jīng)越來越引起人們的廣泛關(guān)注，其新的作用機制及應用

2、正在被進一步認識。
　　 內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，存在于體內(nèi)多種組織。其中骨髓含量最為豐富，其能夠遷移并定向分化為成熟的血管內(nèi)皮細胞。實驗表明，EPCs不僅參與了胚胎時期原始血管網(wǎng)的形成，還參與了出生后血管的修復與新生。臨床前研究也證明EPCs能夠治療肢體缺血，心肌梗死等缺血性疾病，提示EPCs在治療AS中的潛在作用，并逐漸引起了人們的重視。<

3、br>　　 由于人體中EPCs含量較少，含量最豐富的骨髓中也僅占骨髓單個核細胞的1％。因此，在如AS等血管損傷性疾病的治療過程中，選擇恰當?shù)闹委熓侄?，以提高EPCs含量和功能活性，來保證EPCs更加有效地實現(xiàn)血管損傷修復是本實驗的研究重點。普羅布考和西洛他唑現(xiàn)已廣泛應用于臨床，是有效抗動脈粥樣硬化藥物，能夠作用于多種細胞，尤其是血管內(nèi)皮細胞，發(fā)揮其降脂、抗炎、抗氧化等作用，保護內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對于阻止缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展

4、具有重要意義。然而目前，有關(guān)普羅布考和西洛他唑?qū)?nèi)皮祖細胞功能活性影響的研究報道很少。本實驗研究的主要目的是探討普羅布考和西洛他唑?qū)Υ笫蠊撬柙葱詢?nèi)皮祖細胞功能活性的影響，闡明普羅布考和西洛他唑影響下的內(nèi)皮祖細胞介導的血管新生作用的潛在機制，從而為AS等缺血性疾病的治療和新藥的開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離及培養(yǎng)150-200gWistar大鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物部。采用密度梯

5、度離心法從大鼠骨髓中分離單個核細胞，用含有10％胎牛血清的EGM-2MV內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)，置于5％CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔天換液一次，7-9天細胞呈單層密集生長。實驗所用細胞為培養(yǎng)7天左右的原代細胞。
　　 二、大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的鑒定（一）形態(tài)學觀察:倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長特性。
　　 （二）TRICT-CD133和FITC-vWF雙重免疫熒光鑒定取培養(yǎng)第五天的細胞進行檢測。一抗

6、為山羊抗大鼠CD133和兔抗大鼠vWF單克隆抗體，二抗分別為TRICT標記的驢抗山羊和FITC標記的羊抗兔IgG。
　　 三、實驗分組
　　 分為對照組、普羅布考濃度組和西洛他唑濃度組。普羅布考濃度分別為0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L，西洛他唑濃度分別為0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L。
　　 四、內(nèi)皮祖細胞增殖活性

7、的檢測消化收集貼壁細胞，以1×104個/孔的細胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)7天后以藥物作用24小時，采用MTT法檢測細胞的增殖，置酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD490值。
　　 五、內(nèi)皮祖細胞管腔形成的檢測4℃溶解Matrigel膠，將其加入24孔培養(yǎng)板中，孵箱孵育30min，將細胞懸液按1×104個/孔的細胞數(shù)接種于鋪滿Matrigel膠的24孔板上。以藥物作用24小時后，觀察各組細胞的管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度，隨機選取管腔密集的視野

8、處計數(shù)并拍照。
　　 六、Real time RT-PCR檢測CD133和vWF mRNA表達水平收集藥物作用24小時后的EPCs，進行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄后在熒光定量PCR儀上進行擴增，最后計算mRNA的相對表達量，每次實驗每個樣本設3個復孔。
　　 七、統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、EPCs的培養(yǎng)與鑒定原代培養(yǎng)2

9、4h后，細胞大部分呈小圓形;差速貼壁篩選后，培養(yǎng)1d可見少量細胞貼壁;4d后細胞開始伸展成梭形或紡錘形;7d后集落中央為圓形細胞，外周細胞呈梭形，且生長旺盛;大約10d至14d融合成單層，呈內(nèi)皮細胞典型的鋪路石樣形態(tài)。CD133、vWF標記培養(yǎng)第五天的EPCs，可見雙熒光陽性，表明其為正在分化的EPCs。
　　 二、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs增殖的影響在培養(yǎng)的EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μm

10、ol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時，MTT法檢測結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度的普羅布考或西洛他唑均可以促進EPCs的增殖，P值＜0.05。
　　 三、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs管腔形成的影響在培養(yǎng)EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.

11、0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時，Matrigel管腔形成檢測結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度的普羅布考或西洛他唑均可以促進EPCs的管腔形成，P值＜0.05。
　　 四、普羅布考及西洛他唑?qū)PCs分化的影響在培養(yǎng)EPCs中分別加入不同濃度的普羅布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西

12、洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小時，采用實時定量PCR法檢測EPCs表面抗原CD133和vWF的表達情況。結(jié)果表明，與對照組相比，CD133表達減弱，vWF表達增加，P值＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、普羅布考可以促進培養(yǎng)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的增殖、管腔形成及分化能力。
　　 2、西洛他唑可以促進培養(yǎng)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的增殖、管腔形