普羅布考保護血管舒張功能及其對平滑肌細胞表型的影響.pdf

1、第一部分:Probucol通過促進eNOS活化保護H2O2誘導的內皮依賴性血管舒張功能的降低
　　背景:
　　普羅布考(Probucol，PB，又名丙丁酚)是一種人工合成的抗氧化劑。它作為一種雙酚類化合物，具有降低膽固醇、抗氧化、抗炎及抗動脈粥樣硬化等多重作用，最初是作為降脂藥物應用于臨床。臨床試驗、動物及體外實驗發(fā)現probucol對某些病理改變下血管收縮舒張功能有直接作用，并證實其對血管功能的作用獨立于其降脂效果。氧化應

2、激是高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病機制，氧化應激通過作用于血管細胞，從而影響血管的收縮和舒張活性。而probucol的抗氧化性不僅表現在抑制脂質（如低密度脂蛋白LDL）的氧化，也可以清除血液和組織中自由基，這提示probucol的抗氧化作用是否是其影響氧化應激下血管功能改變的機制，以及是否對于心血管疾病的血管舒縮功能有保護作用。
　　血管內皮是維持血管穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)者。已知內皮細胞是血管收縮和舒張活性的重要組成部分，而內皮

3、功能障礙可以導致血管收縮及舒張功能平衡紊亂，血壓調節(jié)異常;此外內皮細胞受損還可以導致血液細胞黏附增加，炎癥細胞浸潤血管以及促-抗凝血平衡失調等。臨床試驗證實內皮細胞功能障礙是心血管事件的危險因素之一。而氧化應激對血管性疾病的發(fā)生發(fā)展有促進作用，活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)首先破壞內皮細胞功能，影響內皮的調壓、抗凝及內分泌合成功能，這可能是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等血管病變的原因之一。
　　目

4、的:
　　Probucol多效性作用機制尚不明確，而且probucol對血管舒縮功能的作用仍有爭議。本實驗為了探討probucol對血管收縮及舒張功能的作用;并根據probucol的抗氧化特性進一步探討，在H2O2誘導氧化損傷基礎下probucol對血管舒張功能的影響及作用機制。
　　方法:
　　使用大鼠離體胸主動脈血管環(huán)構建H2O2損傷內皮依賴性血管舒張功能的模型。(1)使用myograph技術研究離體血管環(huán)的收縮及

5、舒張功能，使用高鉀(KCl)、去氧腎上腺素(PE)分別誘導血管收縮反應，乙酰膽堿(ACh)、硝普鈉(SNP)誘導血管舒張反應（內皮依賴性和非內皮依賴性）。觀察血管在H2O2的持續(xù)作用下，血管基礎功能的變化情況。(2)在H2O2作用的基礎上，myograph檢測PB干預處理對血管功能的影響，并且使用western blot技術檢測干預后血管環(huán)內皮特異性一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表達情況，探討PB對血管環(huán)舒張功能的作用是否是通過影響內皮

6、細胞eNOS的產生來實現的。(3)使用血管環(huán)組織培養(yǎng)技術進一步探討PB對不良應激下內皮依賴性舒張功能的作用，myograph檢測培養(yǎng)后血管環(huán)活性的改變。
　　建立apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型，在體實驗研究在動脈粥樣硬化疾病血管損傷基礎上PB對血管舒張功能的影響，及其對血脂代謝的作用與血管功能改變的相關性
　　培養(yǎng)原代人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），同樣在體外實驗中建立H2O2損傷血管內皮功能的模型，主要進行以下實驗:

7、(1)HUVECs的培養(yǎng)及鑒定;(2)實時熒光定量RT-qPCR及western blot檢測PB對內皮細胞eNOS mRNA、蛋白表達水平的影響，對eNOS活化程度的影響;(2)在H2O2損傷情況下，PB對內皮細胞eNOS表達水平的作用，探討PB是否通過影響eNOS表達來保護內皮細胞功能;(3)免疫熒光顯微鏡觀察以及熒光定量檢測HUVEC在H2O2誘導氧化損傷時NO的生成，以及PB對NO產生的作用，探討PB是否能激活eNOS-NO生成

8、途徑達到保護內皮介導舒張功能的作用。
　　結果:
　　1.H2O2在一定濃度及作用時間下可以誘導氧化損傷，選擇性抑制大鼠離體胸主動脈血管環(huán)ACh誘導的內皮依賴性舒張功能，對血管收縮功能無明顯作用。高濃度或長時間H2O2作用可以造成不可逆的血管收縮及舒張功能的喪失。
　　2.在H2O2誘導的氧化應激下，PB（5-20μM）保護大鼠及小鼠離體胸主動脈血管環(huán)ACh誘導的內皮依賴性血管舒張功能。
　　3.PB通過抑制H2

9、O2誘導的離體血管環(huán)eNOS活性下降，保護內皮細胞功能，但對收縮功能無顯著作用。
　　4.在組織培養(yǎng)過程中，PB對大鼠胸主動脈血管環(huán)的內皮依賴性舒張功能也有保護作用。
　　5.在apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中，PB可以保護小鼠主動脈內皮依賴性舒張功能，且該作用與其降脂效果無關。
　　6.PB可以提高人臍靜脈內皮細胞中p-eNOS/eNOS比值，促進eNOS的磷酸化程度(Ser-1177)，激活eNOS氧化活性;H

10、2O2抑制eNOS總蛋白表達水平，PB保護H2O2誘導氧化損傷情況下eNOS的磷酸化水平。
　　7.PB促進人臍靜脈內皮細胞中eNOS活化的產物NO的產生。
　　結論:
　　PB對于H2O2誘導的內皮依賴性舒張功能障礙有保護作用，其機制可能是PB通過促進eNOS磷酸化，激活eNOS氧化酶活性，從而促進NO的生成有關。
　　第二部分:普羅布考對平滑肌細胞表型的作用及其與平滑肌細胞增殖遷移的關系
　　背景:

11、r>　　血管平滑肌細胞VSMCs作為血管壁的重要構成部分，其功能的異常與心血管疾病有密切關系。VSMCs增殖及合成作用參與動脈粥樣硬化斑塊的形成，平滑肌細胞源性泡沫細胞是斑塊的細胞成分之一。傳統(tǒng)觀點認為平滑肌細胞具有收縮型及合成型兩種表型，而病理改變與合成/增殖型有關。而新觀點認為病變血管周圍或血液來源的干細胞才是斑塊形成的主要細胞來源，它們擁有部分SMC表型標記，但不同于普通平滑肌細胞的功能，擁有更多干細胞的特性，因此提出這種多能干細

12、胞性的平滑肌細胞是SMC參與血管病理改變的基礎。因此SMC干細胞活性增加與血管病灶處SMC增殖或合成作用有關，主要以高分化平滑肌細胞收縮蛋白的降低(包括α-actin、SM22、calponin及SM-MHC(SM1、SM2)以及干細胞標志升高。
　　動物實驗發(fā)現probucol可以抑制家兔主動脈球囊擴張損傷后血管再狹窄，抑制平滑肌細胞增殖和遷移，抑制內膜增厚、管腔變窄，并且改善血管重構。因此我們從SMC對血管疾病的作用機理和表型

13、變化出發(fā)，探討PB的對心血管疾病的保護作用是否與SMC表型有關，及其對SMC增殖遷移的作用。
　　目的:
　　探索probucol對平滑肌細胞增殖及遷移的作用以及該作用是否與平滑肌細胞的表型變化有關。
　　方法:
　　(1)使用組織塊貼壁法提取并培養(yǎng)原代大鼠的血管平滑肌細胞，使用免疫熒光染色鑒定原代VSMCs。觀察原代細胞提取和培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)及增殖分化過程，使用PB干預血管組織塊以觀察細胞從組織塊原位的遷出情

14、況;并且在細胞接種過程中直接計數PB對細胞增殖數目的影響。
　　(2)使用Transwell細胞遷移實驗檢測PB及oxLDL對VSMCs的遷移影響
　　(3)采用RT-qPCR技術、western-blot技術研究VSMCs中表型相關蛋白α-actin、SM22、干細胞標志Sox-10的表達變化，以及平滑肌細胞轉錄激活因子myocardin的表達改變情況。
　　結果:
　　(1)α-actin+SM22+Sox-

15、10-是高分化VSMCs的表型特征;
　　(2)PB單獨作用抑制VSMCs干細胞標志Sox-10的表達，也抑制myocardin、SM22表達，但不影響收縮蛋白α-actin的表達。H2O2誘導氧化應激促進Sox-10表達并下調myocardin表達，而PB可以部分逆轉該變化，即H2O2作用基礎上PB抑制Sox-10，促進myocardin表達。
　　(3)PB抑制VSMCs從組織內遷移以及在體外培養(yǎng)過程中的遷移及增殖速率。