Oat1,Oat3和Mrp2介導(dǎo)JBP485對(duì)大鼠急性肝腎損傷產(chǎn)生的保護(hù)作用及其分子藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)制.pdf

1、目的:急性肝腎損傷是臨床常見(jiàn)疾病，前期研究表明，急性肝腎損傷狀態(tài)下腎臟上有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和3(Oat1，Oat3)及多藥耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）的表達(dá)和功能會(huì)發(fā)生改變。Oat1和Oat3分布在腎小管的上皮細(xì)胞基底膜側(cè)，主要轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陰離子，Mrp2分布在肝細(xì)胞膽管側(cè)膜和腎小管上皮細(xì)胞頂側(cè)膜，可轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性和外源性物質(zhì)。ANIT(alpha-naphthylisothiocyanate)可引起膽管細(xì)胞壞死，造成膽道梗阻。大劑量順鉑(ci

2、splatin)可引起急性腎損傷。JBP485(cyclo-trans-4-L-Hydroxyprolyl-L-serine，環(huán)狀-反式-4-左旋-羥脯氨酰-左旋-絲氨酸)是一種二肽（dipeptide），從日本抗肝炎藥物L(fēng)aennec（人胎盤(pán)水解物）中分離得到，具有一定的抗炎活性。本課題旨在研究JBP485對(duì)ANIT誘導(dǎo)的急性梗阻性黃疸和順鉑引起的急性腎損傷是否有保護(hù)作用，并闡明其保護(hù)機(jī)制是否與腎臟上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Oat1，Oat3和Mrp

3、2的表達(dá)變化有關(guān)。
　　 方法:1急性梗阻性黃疸:大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、急性梗阻性黃疸模型組、陽(yáng)性藥治療組（水飛薊素），JBP485治療組(50mg/kg和100mg/kg)。ANIT給藥48小時(shí)后，眼眶取血，測(cè)定各組大鼠血漿中膽紅素(BIL)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度，之后大鼠頸椎脫位處死取肝臟切片，通過(guò)病理切片觀察肝臟的組織形態(tài)學(xué)變化;ANIT腹腔注射給藥48小時(shí)后，測(cè)定模型組和空白組大鼠的JBP48

4、5血藥濃度，腎排泄以及體外腎切片攝取率;分別提取各組大鼠腎組織的總RNA和蛋白，進(jìn)行RT-PCR和western-blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠Oat1，Oat3和Mrp2的mRNA和蛋白表達(dá)。同時(shí)將各組大鼠在ANIT給藥24h后，放入代謝籠中收集24h尿液，測(cè)定尿液中膽紅素濃度。2急性腎損傷:按不同處理方式將大鼠分為正常對(duì)照組、模型組、JBP485治療組。順鉑給藥72小時(shí)后，眼眶取血，測(cè)定各組大鼠血漿中肌酐(creatinine)，

5、尿素氮(BUN)和硫酸吲哚酚(indoxylsulfate，IS)的含量，之后大鼠頸椎脫位處死取腎臟，測(cè)定其丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;模型組和空白組大鼠在腹腔注射順鉑72小時(shí)后，觀察PAH血藥濃度，腎排泄以及體外腎切片攝取率;順鉑造模72h后，分別提取各組大鼠腎組織的總RNA和蛋白，進(jìn)行qRT-PCR，western-blotting，免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠Oat1，Oat3和Mrp2的mRNA和蛋白表

6、達(dá)。同時(shí)各組大鼠在順鉑給藥48h后，放入代謝籠中收集24h尿量，測(cè)定尿液中硫酸吲哚酚濃度。
　　 結(jié)果:1急性梗阻性黃疸:(1)與正常對(duì)照組相比，急性梗阻性黃疸組:1）血漿中BIL、ALT及AST含量顯著增加;2）組織形態(tài)學(xué)觀察，肝組織失去原有正常組織形態(tài)而呈現(xiàn)出明顯的病理?yè)p傷現(xiàn)象，表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫狀、胞漿著色變淺、胞核增大、肝竇擴(kuò)張且有明顯的瘀血，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及片狀壞死灶;3）JBP485靜脈注射后，血藥濃度增高，尿累

7、積排泄率降低，體外腎切片實(shí)驗(yàn)顯示JBP485攝取率降低;4）腎臟Oat1和Oat3的mRNA和蛋白表達(dá)下降，Mrp2的mRNA和蛋白表達(dá)增多;(5)24h和48h累積尿液中BIL濃度顯著增加。(2)與急性梗阻性黃疸組相比，JBP485治療組:1)JBP485顯著降低BIL、ALT及AST含量，效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥（水飛薊素）;2）組織形態(tài)學(xué)上觀察，肝臟的受損程度明顯減弱，表現(xiàn)為壞死面積不明顯或縮小，肝細(xì)胞膨脹減輕，肝小葉邊界明顯，炎性細(xì)胞

8、浸潤(rùn)大大減少;3）腎臟上Oat1和Mrp2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增多;(4)24h和48h尿累積排泄中膽紅素濃度進(jìn)一步增加。2.急性腎損傷:(1)與正常對(duì)照組相比，模型組:1）血漿中肌酐，尿素氮，硫酸吲哚酚濃度顯著增加;2）腎小球?yàn)V過(guò)率下降;3）腎組織中MDA濃度明顯升高，SOD濃度下降;4)PAH靜脈注射后，血藥濃度增高，累積尿排泄率降低，體外腎切片實(shí)驗(yàn)顯示PAH攝取率降低;5）腎臟上Oat1和Oat3的mRNA和蛋白表達(dá)下降，M

9、rp2的mRNA和蛋白表達(dá)提高;6）免疫組化和免疫熒光顯示Oat1和Oat3的表達(dá)降低;7）順鉑注射48h后，收集24h尿液，尿液中IS濃度顯著增加。(2)與模型組相比，JBP485治療組:1)JBP485顯著降低血漿中creatinine、BUN及IS濃度;2）腎小球?yàn)V過(guò)率明顯升高;3）腎臟組織中MDA濃度下降，SOD濃度升高;4）腎臟上Mrp2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著提高;5）免疫組化和免疫熒光顯示Oat1和Oat3的表達(dá)有所恢復(fù);

10、6）順鉑注射48h后，收集24h尿液，尿液中IS濃度進(jìn)一步增加。
　　 結(jié)論:(1)急性肝腎損傷可引起攝取類(lèi)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體Oat1和Oat3的表達(dá)和功能降低，外排類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2的表達(dá)和功能增加;(2)急性肝腎損傷后，腎臟Mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的提高是機(jī)體的一種自我保護(hù)反應(yīng)，減輕毒物蓄積;(3)JBP485可以進(jìn)一步提高急性肝腎損傷狀態(tài)下腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2的表達(dá)和功能，使毒物排出增多，肝腎負(fù)擔(dān)減輕，從而治療由ANIT引起的膽道梗阻和由順