葛根素對轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的甲氨蝶呤藥代動力學(xué)、腎損傷、逆轉(zhuǎn)K562-ADR細(xì)胞多藥耐藥的分子藥代動力學(xué)機(jī)制.pdf

1、第一部分，應(yīng)用LC-MS/MS建立同時測定生物樣品中甲氨蝶呤和葛根素的分析方法
　　目的:建立一種靈敏、快速、高效、專屬的LC-MS/MS方法用于同時測定生物樣品中甲氨蝶呤和葛根素的濃度。
　　方法:生物樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，氮氣吹干并復(fù)溶，應(yīng)用Hypersil ODS-C18色譜柱分離，流動相為乙腈-甲酸水(40∶60，v/v);流速為0.3ml/min。采用電噴霧離子源（ESI源）多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，正離子掃描分析

2、m/z455.2→308.2（甲氨蝶呤），m/z414.9→266.7（葛根素），m/z370.4→288.1（西洛他唑，內(nèi)標(biāo)）。
　　結(jié)果:甲氨蝶呤和葛根素的線性范圍為1～1000 ng/ml，日內(nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于15％。
　　結(jié)論:建立了靈敏、快速的LC-MS/MS法同時測定生物樣品中的甲氨蝶呤和葛根素的濃度，并成功應(yīng)用于藥代動力學(xué)研究。
　　第二部分，葛根素影響甲氨蝶呤藥代動力學(xué)的分子機(jī)制研究

3、　　目的:揭示葛根素影響甲氨蝶呤藥動學(xué)的分子機(jī)制，為臨床合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。
　　方法:采用大鼠in vivo口服和靜注、in vitro翻轉(zhuǎn)腸實驗、腎切片攝取實驗以及MDR1-MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)運實驗、OAT1/3-HEK293細(xì)胞攝取實驗考察葛根素對甲氨蝶呤藥代動力學(xué)的影響和分子機(jī)制，生物樣品中葛根素和甲氨蝶呤的含量應(yīng)用LC-MS/MS檢測。
　　結(jié)果:合用葛根素后，甲氨蝶呤的口服生物利用度提高了58％，靜注甲氨蝶呤時腎臟

4、清除率顯著下降（從1.91±0.09 ml/min下降為0.82±0.07 ml/min）。葛根素可顯著提高甲氨蝶呤的體外腸吸收，并抑制腎切片對甲氨蝶呤的攝取。同時，葛根素抑制MDR1-MDCK細(xì)胞外排地高辛轉(zhuǎn)運的IC50為1.6μM，且可顯著抑制甲氨蝶呤經(jīng)MDR1-MDCK細(xì)胞的外排轉(zhuǎn)運。此外，OAT1/3-HEK293細(xì)胞攝取葛根素與mock-HEK293沒有差異，但葛根素可抑制OAT1/3-HEK293細(xì)胞對經(jīng)典底物（PAH和PC

5、G）和甲氨蝶呤的攝取。
　　結(jié)論:葛根素影響甲氨蝶呤藥動學(xué)的分子靶點為腸道P-gp和腎臟OATs，葛根素是P-gp和OATs的抑制劑，提示葛根素與甲氨蝶呤或其他P-gp及OATs底物合用時，可能發(fā)生潛在的藥物相互作用。
　　第三部分，葛根素對甲氨蝶呤腎損害的影響及其分子藥代動力學(xué)機(jī)制
　　目的:通過多劑量的葛根素改善甲氨蝶呤引起的大鼠腎損傷探索轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)葛根素緩解腎損傷的分子藥代動力學(xué)機(jī)制。
　　方法:大鼠灌胃葛

6、根素(50mg/kg/d)三天后，考察甲氨蝶呤藥代動力學(xué)改變。此外，大鼠腹腔注射甲氨蝶呤(7 mg/kg/d)三天后，葛根素灌胃治療三天(50mg/kg/d)，考察大鼠血清肌酐、尿素氮、硫酸吲哚吩的改變以及大鼠腎臟病理切片的變化。
　　結(jié)果:葛根素給藥后，甲氨蝶呤的血藥濃度下降增快，腎切片對甲氨蝶呤的攝取增加。Real time PCR實驗表明葛根素誘導(dǎo)Oat1/3的表達(dá)，從而加快對甲氨蝶呤的腎清除。甲氨蝶呤連續(xù)給藥后，血肌酐、尿

7、素氮和硫酸吲哚酚等內(nèi)源性代謝物質(zhì)的血漿濃度升高，腎臟出現(xiàn)明顯的病理改變。而合用葛根素并不能避免腎損害的發(fā)生，但是可加快內(nèi)源性代謝物質(zhì)的排泄，通過上調(diào)Oat1/3可改善腎組織的病理改變。同時，葛根素能部分逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤處理后的BCL6表達(dá)下調(diào)和PEG2的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:葛根素可通過BCL6和PEG2上調(diào)Oat1/3，加快甲氨蝶呤的腎排泄，從而改善甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腎毒性。
　　第四部分，葛根素抑制NF-κB通路逆轉(zhuǎn)K562/A

8、DR細(xì)胞多藥耐藥
　　目的:探討葛根素逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　方法:通過MTT、qRT-PCR、Western Blotting、流式細(xì)胞術(shù)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等實驗考察葛根素逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞對阿霉素的耐藥性及其分子機(jī)制。
　　結(jié)果:K562/ADR對阿霉素的敏感性顯著降低，并且MDR1/P-gp的表達(dá)分別增高了6.58和4.62倍。qRT-PCR和Western Blotting實驗結(jié)果證實