重組ACE抑制肽與抗氧化肽的共表達(dá)及聯(lián)合降壓效應(yīng).pdf

1、高血壓是造成心腦血管疾病死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅著人類健康。食源性ACE抑制肽和抗氧化肽可通過作用于不同的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)而起到降血壓作用，具有作用溫和、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究熱點(diǎn)。從天然蛋白酶解產(chǎn)物中分離提取活性短肽的方法工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高，限制了活性短肽的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。本論文擬采用基因工程法結(jié)合高密度發(fā)酵技術(shù)，大批量同時(shí)制備多種ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）抑制肽和抗氧化肽，旨在開發(fā)能基于不同作用機(jī)制發(fā)揮聯(lián)合降壓效應(yīng)的復(fù)合肽產(chǎn)品。

2、主要研究內(nèi)容為:設(shè)計(jì)活性肽多聚體，構(gòu)建重組菌株;優(yōu)化融合蛋白表達(dá)條件;純化融合蛋白及活性肽多聚體;研究活性肽多聚體酶解寡肽的體內(nèi)外降壓效應(yīng)。
　　設(shè)計(jì)了活性肽多聚體并構(gòu)建了基因工程菌?；诨钚噪臉?gòu)效特點(diǎn)、胃腸酶酶切特性及多肽表達(dá)的生物信息學(xué)分析，將IVY等ACE抑制肽與DTHK等抗氧化肽設(shè)計(jì)組裝成能被胃腸酶靶向激活的活性肽多聚體BPP-1，構(gòu)建了能表達(dá)與分離BPP-1的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-6×Hi

3、s-SUMO-BPP-1。結(jié)果顯示，工程菌經(jīng)37℃、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后，融合蛋白6×His-SUMO-BPP-1以包涵體的形式獲得高效表達(dá)，表達(dá)量約占全細(xì)胞蛋白的53.64％。
　　優(yōu)化了工程菌表達(dá)融合蛋白的搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)條件。通過對甘油濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度及培養(yǎng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)優(yōu)化，確定了工程菌適宜的搖瓶培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基中甘油濃度為4 ml/L，接種8h后誘導(dǎo)，0.6 mmol/L IPTG，

4、37℃，培養(yǎng)14h。該條件下，工程菌OD600和干重分別達(dá)到16.0和6.1 g/L，目標(biāo)蛋白占全細(xì)胞蛋白的59.09％。進(jìn)一步采用3L發(fā)酵罐研究了分批發(fā)酵、恒速流加發(fā)酵和指數(shù)流加發(fā)酵方式對工程菌發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示在溶氧不低于20％，pH7.0，指數(shù)流加10％甘油(v/v)，培養(yǎng)20 h條件下，工程菌OD600和干重分別達(dá)到65.0和24.8 g/L，目標(biāo)蛋白占全細(xì)胞蛋白的63.46％。
　　研究了融合蛋白及活性肽多聚體的制備條

5、件。通過包涵體洗滌、溶解和親和純化，可從1L工程菌發(fā)酵液中獲得1.93 g融合蛋白，純度達(dá)到94.88％。進(jìn)一步通過SUMO蛋白酶酶切和親和純化，可獲得純度為98.05％的多聚體BPP-1，得率為91.06％，產(chǎn)量達(dá)到0.564g/L。胰蛋白酶消化及UPLC-MADIL-TOF-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果表明多聚體BPP-1獲得正確表達(dá)。BPP-1經(jīng)體外模擬消化后，其酶解寡肽顯示了極強(qiáng)的ACE抑制活性(IC50=0.004 mg/mL)和抗氧化

6、活性，表明BPP-1中的活性肽單體可通過胃腸酶高效釋放。
　　研究了BPP-1酶解寡肽的體內(nèi)生物活性。通過CCK-8法、ELISA、熒光探針法、流式細(xì)胞術(shù)等手段研究BPP-1酶解寡肽對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞活力、NO（一氧化氮）、ET-1（內(nèi)皮素-1）、MDA（丙二醛）及ROS（活性氧）的影響。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能明顯誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡和氧化損傷，而酶解寡肽能顯著提高細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡率，且呈劑量效應(yīng);能