泥鰍蛋白源ACE抑制肽的酶法制備及其降壓活性研究.pdf

1、論文以泥鰍蛋白為原料，運(yùn)用可控酶解技術(shù)，制備高活性降血壓肽。經(jīng)過超濾、凝膠過濾、反相高效液相色譜層析及質(zhì)譜測(cè)序等技術(shù)分離、純化并鑒定泥鰍降血壓肽，通過體外、體內(nèi)活性試驗(yàn)確定降血壓肽的降壓活性。采用z-scales描述符構(gòu)建了ACE抑制四肽的定量構(gòu)效關(guān)系模型，為指導(dǎo)和設(shè)計(jì)新化合物提供理論依據(jù)。
　　 首先分析了泥鰍的基本營(yíng)養(yǎng)成分，從氨基酸組成的角度評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。泥鰍的蛋白含量17.4％,脂肪含量?jī)H1.5％，灰分1.3％,水分77

2、.2％,是一種典型的高蛋白低脂肪食品。除蛋氨酸外，蛋白質(zhì)中的必需氨基酸含量都高于FAO/WHO模式。泥鰍蛋白的必需氨基酸總含量達(dá)到42.52％，高于WHO衡量理想蛋白資源推薦的比值36％。蛋氨酸和半胱氨酸是泥鰍蛋白的第一限制性氨基酸。功效比值PERⅠ值為2.9，PERⅡ值為2.9，PERⅢ值為2.3，氨基酸組成平衡性很好。高含量的疏水性氨基酸(47.9％)、芳香族氨基酸(13.3％)以及支鏈氨基酸(17.7％)是酶法生產(chǎn)ACE抑制肽的優(yōu)

3、良物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 廣泛選取植物來源、動(dòng)物來源及微生物來源的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解泥鰍蛋白，通過比較9種不同蛋白酶水解產(chǎn)物的半抑制濃度IC50，得到酶解泥鰍蛋白的最適用酶為菠蘿蛋白酶。通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，得到高活性ACE抑制肽的最佳制備工藝:[E]/[S]4.9‰，底物濃度30％，pH6.5，溫度54.4℃，酶解時(shí)間5.9 h。泥

4、鰍蛋白降血壓肽的ACE抑制率(Y)對(duì)[E]/[S]（A）、溫度(B)和酶解時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=82.17+4.81A+5.57B+3.86C-4.16B2-3.97AB+4.27AC。在最佳酶解條件下，菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白的酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的含量顯著增加，泥鰍多肽的ACE抑制率為88.9％。
　　 論文使用超濾、 Sephadex G-15凝膠柱層析、AKTA半制備反相高效液相色譜

5、和分析型反相高效液相色譜等多級(jí)分離技術(shù)，根據(jù)酶解產(chǎn)物中肽的分子量大小及疏水性差異逐級(jí)純化，得到目標(biāo)肽段的IC50值為18.2±0.9μg/mL，純化倍數(shù)33.7，蛋白回收率5.2％。通過TOF-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定目標(biāo)肽段的氨基酸序列為Ala-His-Leu-Leu，相對(duì)分子質(zhì)量452.2 Da。經(jīng)肽譜庫和文摘檢索，該肽段為首次發(fā)現(xiàn)的ACE抑制四肽。
　　 泥鰍多肽在較寬的pH值(3-9)范圍內(nèi)具有優(yōu)良的溶解性能，氮溶解指數(shù)均

6、在70％以上。溶液pH7.0時(shí)，泥鰍多肽具有較好的乳化能力(60.8％)和乳化穩(wěn)定性(68.6％)。泥鰍蛋白水解后，起泡性及起泡穩(wěn)定性分別降低15.8％和15.5％; DPPH·清除率和 ABTS·+清除率分別提高6.1倍和2.7倍，抗氧化能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。溫度≤80℃的中性條件下加熱2h，泥鰍降血壓肽的ACE抑制率沒有顯著變化(P＞0.05);100℃下加熱2h，泥鰍降血壓肽的ACE抑制率仍保持80％左右。在酸性至中性范圍

7、內(nèi)，泥鰍降血壓肽的ACE抑制活性變化不顯著;當(dāng)pH≥8時(shí)，其降壓活性與pH值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。與噴霧干燥相比，冷凍干燥后所得產(chǎn)品的顆粒較大、復(fù)溶速度較快、降壓活力的損失較低。室溫下，泥鰍多肽溶液中添加5 mmol/L金屬離子靜置2h，Mg2+對(duì)降壓活性起到促進(jìn)作用，Zn2+和Mn2+抑制了多肽的降壓活性。泥鰍多肽溶液中添加食品配料，在121℃加熱反應(yīng)20 min，結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度的升高，泥鰍多肽的ACE抑制活性逐漸降低，褐變程度加深

8、;氯化鈉在低濃度范圍內(nèi)，對(duì)降壓活性的影響顯著，當(dāng)濃度≥9％時(shí)，其降壓活性與氯化鈉濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。
　　 泥鰍降壓肽的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，泥鰍多肽與底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ACE的活性結(jié)合部位，從而起到抑制ACE活性的作用。在模擬胃腸道消化體系中，胃蛋白酶的消化作用顯著提高了產(chǎn)物的降壓活性。但是經(jīng)過胰蛋白酶消化后，泥鰍多肽的ACE抑制活性顯著下降（P＜0.05）。泥鰍多肽屬于底物型ACE抑制肽。
　　 以原發(fā)性高血壓大鼠(SHR

9、)為動(dòng)物模型，采用尾脈搏法測(cè)定大鼠的收縮壓，從急性和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)泥鰍多肽的體內(nèi)降壓效果。急性降壓試驗(yàn)中，一次性灌胃14h，收縮壓達(dá)到最低值，血壓降低29 mmHg，之后血壓出現(xiàn)回升。SHR灌胃泥鰍多肽2個(gè)月，大鼠心率無顯著變化;SHR大鼠的體重顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。在灌胃泥鰍多肽的8周期間，SHR高劑量組0周的平均收縮壓為195.0 mmHg，4周降到最低點(diǎn)165.1mmHg，隨后血壓值略有升高，8周高劑量組和低劑量組的S

10、BP值分別降低24.3 mmHg和10.5 mmHg，均表現(xiàn)出良好的降血壓效果。與對(duì)照組相比，SHR高劑量組大鼠的腹主動(dòng)脈體重比顯著上升（P＜0.05），心體重比顯著下降(P＜0.05)，泥鰍多肽起到了一定保護(hù)器官的作用。SHR高劑量組大鼠血清中甘油三酯含量顯著降低（P＜0.05），鈉離子濃度顯著降低(P＜0.05)。8周后大鼠血清與腹組織中的丙二醛含量顯著降低（P＜0.05），泥鰍多肽對(duì)SHR大鼠部分器官和血清的脂質(zhì)過氧化損傷起到緩解

11、和抑制作用。SHR高劑量組大鼠的血清中總游離氨基酸含量高于空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組，其中His、Ala、Glu、Leu、Ile的含量明顯增高（P＜0.05）。SHR高劑量組大鼠的腹主動(dòng)脈ACE酶活性顯著降低17.6％(P＜0.05)，推斷泥鰍多肽的作用靶點(diǎn)位于腹主動(dòng)脈。
　　 泥鰍蛋白酶解物中分離到一種高活性的降血壓四肽，論文對(duì)四肽的定量構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究。采用z-scales描述符，對(duì)92組ACE抑制四肽進(jìn)行編碼，通過Matl

12、ab軟件偏最小二乘法對(duì)多元數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到ACE抑制四肽的QSAR模型:y=2.1519+0.0704x1+0.0443x2+0.0166x3+0.0302x4-0.0758x5-0.0084x6-0.031x7+0.1372x8-0.0629x9+0.0256x10+0.0396x11+0.035 x12。模型的相關(guān)系數(shù)R為0.7489，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv2為0.5956，預(yù)測(cè)能力和擬合度較強(qiáng)。泥鰍蛋白源的ACE抑制四肽AH