EphB4通過(guò)骨膜蛋白促進(jìn)CTLA4修飾的MSCs有效成骨的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本次研究通過(guò)利用CTLA4修飾的MSCs來(lái)構(gòu)建TEB，一方面采用不同的動(dòng)物移植模型來(lái)驗(yàn)證成骨修復(fù)效果，另一方面在體外利用免疫激活共培養(yǎng)體系驗(yàn)證其對(duì)于MSCs-CTLA4中EphB4和POSTN表達(dá)的影響，并揭示EphB4與POSTN之間的關(guān)系，最后探索EphB4通過(guò)POSTN促進(jìn)MSCs-CTLA4成骨分化的機(jī)制，旨在為進(jìn)一步闡明MSCs-CTLA4在異體移植中有效成骨的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　第一部分 Ep

2、hB4在CTLA4修飾的MSCs異位成骨中的作用
　　方法：
　　1.密度梯度離心法分離MSCs，采用DBM雙面接種法構(gòu)建TEB，然后將TEB置于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)14天。在植入小鼠體內(nèi)前更換常規(guī)培養(yǎng)基，利用CTLA4腺病毒載體進(jìn)行感染，構(gòu)建表達(dá)CTLA4的TEB。
　　2.建立小鼠股骨旁TEB異位移植模型，Micro-CT分析異位成骨情況。后續(xù)制備移植區(qū)域組織切片，HE及Masson染色觀察組織形態(tài)，免疫組化染色觀

3、察CTLA4及EphB4的表達(dá)情況。
　　3.體外利用植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)來(lái)建立免疫激活微環(huán)境，然后將MSCs或MSCs-CTLA4置于其中共培養(yǎng)，建立免疫激活共培養(yǎng)體系。
　　4.ELISA測(cè)定共培養(yǎng)體系中IL-2和IFN-γ的表達(dá)情況。Q-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)

4、測(cè)定免疫激活共培養(yǎng)前后MSCs及MSCs-CTLA4中EphB4的表達(dá)情況。
　　5.ephrinB2-FC激活EphB4后，利用Q-PCR、免疫熒光、特殊染色法測(cè)定相關(guān)成骨標(biāo)志物表達(dá)情況。
　　6.為了探索EphB4促進(jìn)MSCs成骨分化的具體機(jī)制，構(gòu)建了EphB4過(guò)表達(dá)及siRNA載體作為對(duì)照組，利用Western blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)定EphB4激活后相應(yīng)信號(hào)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.普通光鏡觀

5、察結(jié)果顯示，接種了MSCs的DBM可見(jiàn)細(xì)胞形成膜樣結(jié)構(gòu)并附著于DBM支架上;熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示在MSCs-CTLA4構(gòu)建的DBM中可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，證明攜帶CTLA4基因的腺病毒感染TEB成功。
　　2.小鼠股骨旁TEB異位移植區(qū)組織切片中，免疫組化測(cè)定CTLA4的陽(yáng)性表達(dá)僅在DBM+MSCs-CTLA4組中可見(jiàn)，其余組均為陰性染色。免疫熒光染色結(jié)果顯示EphB4在DBM+MSCs-CTLA4組中的表達(dá)量顯著高于其余組。H

6、E、Masson染色和Micro-CT三維重建結(jié)果均顯示相對(duì)于其他組，DBM+MSCs-CTLA4組中可見(jiàn)明顯的新生骨組織區(qū)。相關(guān)骨生成數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示DBM+MSCs-CTLA4組在新生骨量與骨體積比(BV/TV)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)中顯著高于其余三組，而在骨小梁分離度(Tb.Sp)中顯著低于其余三組(P＜0.05)。
　　3.未激活狀態(tài)下的PBMCs在培養(yǎng)基中呈分散排布，當(dāng)加入PHA刺激后，PBM

7、Cs中的T淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化，成團(tuán)聚集在一起。光鏡下顯示MSCs-CTLA4共培養(yǎng)組中PBMCs的聚集程度顯著低于MSCs共培養(yǎng)組。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示IL-2和IFN-γ在MSCs-CTLA4共培養(yǎng)組中的表達(dá)水平顯著低于MSCs共培養(yǎng)組(P＜0.05)。
　　4.Western blotting結(jié)果顯示在免疫激活微環(huán)境中，EphB4在MSCs中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而在MSCs-CTLA4中則維持了正常水平，Q-PCR結(jié)果趨勢(shì)與其

8、一致(P＜0.05)。
　　第二部分 EphB4信號(hào)上調(diào)MSCs中骨膜蛋白的表達(dá)
　　方法：
　　1.制作小鼠股骨旁TEB異位移植區(qū)組織切片，免疫組化測(cè)定POSTN表達(dá)情況。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定POSTN在MSCs中表達(dá)定位情況，同時(shí)Western blotting、Q-PCR、ELISA測(cè)定EphB4激活后POSTN的蛋白、基因表達(dá)及體外分泌情況。
　　3.利用NVP-BHG-712、Integri

9、nαvβ3封閉抗體、EphB4過(guò)表達(dá)及siRNA載體來(lái)設(shè)立對(duì)照組，Q-PCR及特殊染色法檢測(cè)EphB4激活后各組細(xì)胞的成骨分化情況，Western blotting檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化染色結(jié)果顯示MSCs-CTLA4組中POSTN的染色顯著強(qiáng)于其余組，IOD分析結(jié)果與肉眼觀察一致(P＜0.05)。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示POSTN定位于MSCs胞質(zhì)中。各組經(jīng)ephrinB2

10、-FC刺激后，MSCs組和EphB4過(guò)表達(dá)組中POSTN的蛋白，mRNA和培養(yǎng)基中的蛋白分泌水平都顯著高于其余組(P＜0.05)，而EphB4-siRNA組和NVP-BHG-712組則與空白組表達(dá)水平相近。
　　3.Q-PCR結(jié)果顯示Runx2、Osterix、COL1和ALP的mRNA水平在ephrinB2-FC刺激組、EphB4過(guò)表達(dá)組和POSTN刺激組中都有明顯增高(P＜0.05)，而在BHG712阻斷劑組、Integrin

11、αvβ3封閉組和EphB4-siRNA組中上調(diào)趨勢(shì)不明顯。ALP及茜素紅染色及IOD分析結(jié)果與上述各成骨標(biāo)志物的mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。Western blotting結(jié)果顯示MSCs在ephrinB2-FC刺激下，單純刺激組和EphB4過(guò)表達(dá)組GSK-3β的磷酸化水平均增高，伴隨β-catenin、Runx2和COL1的表達(dá)增高，而EphB4-siRNA組、Integrinαvβ3封閉組和BHG712阻斷劑組未觀察到此現(xiàn)象。
　　

12、第三部分 骨膜蛋白在CTLA4修飾的MSCs成骨修復(fù)中的作用及機(jī)制研究
　　方法：
　　1.建立兔橈骨缺損TEB原位移植模型，X-ray及Micro-CT分析成骨修復(fù)情況。后續(xù)制備移植區(qū)域組織切片，HE及Masson染色觀察組織形態(tài)，免疫組化染色觀察POSTN及β-catenin的表達(dá)情況。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定POSTN在MSCs中表達(dá)定位情況，Q-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)定免疫激活共培養(yǎng)前

13、后MSCs及MSCs-CTLA4中POSTN的表達(dá)情況。
　　3.ALP及茜素紅染色測(cè)定MSCs及MSCs-CTLA4在免疫激活共培養(yǎng)前后對(duì)于POSTN成骨誘導(dǎo)效應(yīng)的反應(yīng)。
　　4.Western blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)定POSTN促進(jìn)MSCs成骨分化的具體機(jī)制
　　結(jié)果：
　　1.X-ray及Micro-CT結(jié)果均顯示8周后DBM+MSCs-CTLA4組修復(fù)區(qū)新生骨塑形明顯優(yōu)于其余組，且橫斷面顯示MSCs-CT

14、LA4組修復(fù)區(qū)橈骨髓腔已完全再通，而其余兩組仍有不同程度的阻塞。相關(guān)骨生成數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示DBM+MSCs-CTLA4組中BMD，BV及BV/TV均高于其余兩組(P＜0.05)。免疫組化測(cè)定POSTN及β-catenin的表達(dá)強(qiáng)度在DBM+MSCs-CTLA4組中顯著高于其余兩組，IOD分析結(jié)果同觀察一致(P＜0.05)。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示MSCs及MSCs-CTLA4中的POSTN陽(yáng)性染色均定位于胞質(zhì)中。West

15、ern blotting及Q-PCR結(jié)果顯示在免疫激活共培養(yǎng)條件下，MSCs中POSTN的表達(dá)相對(duì)普通培養(yǎng)條件來(lái)說(shuō)顯著降低(P＜0.05)，而MSCs-CTLA4組中POSTN的表達(dá)則保持在正常水平。
　　3.ALP及茜素紅染色結(jié)果顯示，POSTN的刺激可以顯著提高M(jìn)SCs及MSCs-CTLA4中兩者的染色程度，而Integrinαvβ3封閉組可見(jiàn)該效應(yīng)被抑制。同時(shí)在免疫激活共培養(yǎng)后，POSTN上調(diào)ALP及鈣結(jié)節(jié)生成的效應(yīng)僅在MS

16、Cs-CTLA4組中可見(jiàn)，而在MSCs組中未觀察到此現(xiàn)象。IOD分析結(jié)果與觀察結(jié)果一致(P＜0.05)。
　　4.Western blotting結(jié)果顯示POSTN的刺激可上調(diào)MSCs組和MSCs-CTLA4組中低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(lipoprotein-related p rotein，LRP)6的磷酸化水平，同時(shí)p-GSK-3β的水平也隨之增高，伴隨β-catenin和Runx2的表達(dá)上調(diào)，而Integrinαvβ3抑制

17、劑組則未見(jiàn)此效應(yīng)發(fā)生。在免疫激活共培養(yǎng)后，該效應(yīng)只在MSCs-CTLA4組中可見(jiàn)，而在MSCs組中未觀察到此現(xiàn)象。
　　全文結(jié)論：
　　1.MSCs-CTLA4構(gòu)建的TEB在小鼠股骨旁異位移植模型中能夠有效成骨，且EphB4表達(dá)顯著高于其余組。體外免疫激活微環(huán)境可下調(diào)MSCs中EphB4的表達(dá)水平，而CTLA4的存在能夠維持MSCs中EphB4的表達(dá)。同時(shí)EphB4可通過(guò)與Wnt信號(hào)通路發(fā)生間接交聯(lián)反應(yīng)來(lái)促進(jìn)MSCs的成骨分

18、化。
　　2.EphB4的激活可以上調(diào)MSCs中POSTN的表達(dá)水平。
　　3.MSCs-CTLA4構(gòu)建的TEB在兔橈骨缺損原位移植模型中成骨修復(fù)效果顯著，且移植區(qū)修復(fù)區(qū)POSTN的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。體外免疫激活微環(huán)境可下調(diào)MSCs中POSTN的表達(dá)水平，且能抑制POSTN對(duì)于MSCs的成骨誘導(dǎo)效應(yīng)，而CTLA4的存在能夠逆轉(zhuǎn)該趨勢(shì)。
　　4.POSTN可與Wnt信號(hào)通路發(fā)生直接交聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)激活Wnt/LRP6/