痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥小鼠SLC2A9、SLC22A12的影響及療效觀察.pdf

1、目的:
　　痛風(fēng)患者因社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展而逐年增加，目前，我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展飛速，人們的物質(zhì)生活水平普遍較高，營(yíng)養(yǎng)過剩、運(yùn)動(dòng)減少等因素導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)病率直線上升。而長(zhǎng)期的高尿酸血癥極易誘發(fā)痛風(fēng)發(fā)作，還會(huì)累及腎臟、心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病。目前，高尿酸血癥所致的疾病已成為一大隱患，給病人帶來(lái)了難以忍受的痛苦，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，增加了國(guó)家和個(gè)人的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。高尿酸血癥及其所致的相關(guān)疾病已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究界的重要課題。
　　臨

2、床上認(rèn)為高尿酸血癥是指血液中的尿酸濃度持續(xù)超出正常范圍的一種機(jī)體狀態(tài)，一般認(rèn)為正常男性血液中的尿酸濃度不大于400μmmol/L，正常女性血液中的尿酸濃度不大于360μmmol/L，否則應(yīng)考慮為高尿酸血癥。尿酸持續(xù)性升高或長(zhǎng)期嘌呤代謝紊亂將導(dǎo)致一系列急、慢性疾病。多年來(lái)，高尿酸血癥一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，作為一種代謝性疾病及臨床上常見的一種體征和疾病的發(fā)病機(jī)制，在許多疾病過程中如:腎病、冠心病、高血壓病、糖尿病、肥胖等都發(fā)揮重要作用。

3、因此，降低血尿酸成為了治療高尿酸血癥造成的各種急慢性疾病的關(guān)鍵所在。
　　近代西方醫(yī)學(xué)相關(guān)理論及證據(jù)證明高尿酸血癥是與遺傳基因的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的SLC2A9基因和SLC22A12基因有很高的相關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為SLC2A、SLC22A12蛋白基因的表達(dá)可以反映機(jī)體尿酸水平。因此本課題組認(rèn)為治療高尿酸血癥可以通過改變或降低SLC2A、SLC22A12蛋白活性達(dá)到降低血尿酸的目的，以取得療效。提出提高臨床療效及研究和探索臨床藥物的治療機(jī)

4、制和原理可以從SLC2A9、SLC22A12這兩個(gè)基因的表達(dá)入手。
　　根據(jù)中醫(yī)藏象功能與高尿酸血癥的關(guān)系，認(rèn)為脾腎兩臟與高尿酸血癥關(guān)系密切，本課題認(rèn)為“高尿酸血癥是‘脾腎虧虛’所致的濕熱瘀阻證，并與五臟理論相關(guān)。脾主運(yùn)化及腎主水功能失司可表現(xiàn)為尿酸升高;脾主運(yùn)化及腎主水功能失司可表現(xiàn)為尿酸升高;甚則肌肉關(guān)節(jié)疼痛紅腫，其中脾主運(yùn)化功能失司主要表現(xiàn)為肌肉紅腫疼痛，腎主水功能失司主要表現(xiàn)為骨骼關(guān)節(jié)疼痛;運(yùn)用清利濕熱‘痛風(fēng)方’治療高尿酸

5、血癥是通過改變與SLC2A9、SLC22A12的表達(dá)來(lái)降低OXD活性及血尿酸以取得療效的”。認(rèn)為血尿酸水平高即中醫(yī)所言的痰濁、濕濁內(nèi)蘊(yùn)，瘀血阻絡(luò)，侵襲人體皮肉筋脈所致。而這一系列變化的本質(zhì)都是由于脾失健運(yùn)，腎主水功能失調(diào)所致，其治療方法采用清熱祛濕，活血散結(jié)的方藥進(jìn)行治療，研究SLC2A9、SLC22A12的表達(dá)變化，探討痛風(fēng)方的治病原理。因此，從脾腎兩臟研究高尿酸血癥的實(shí)質(zhì)對(duì)于豐富中醫(yī)藏象及病因理論，探索清熱祛濕，活血散結(jié)的方藥防治高

6、尿酸血癥相關(guān)疾病，找出痛風(fēng)方的作用靶點(diǎn)具有重大意義。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)研究
　　以SPF級(jí)成年KM小鼠作為研究對(duì)象。根據(jù)體重，采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常組（A組）、模型組（B組）、低劑量組（C組）、中劑量（D組）、高劑量組（E組）、陽(yáng)性藥物組（F組），共6組，每組12只，共72只。正常組不造模，每天給予生理鹽水1ml/只灌胃進(jìn)行對(duì)比;模型組給予升高血尿酸藥物并連續(xù)1ml/只生理鹽水灌胃5天進(jìn)行造模;低劑量組給予

7、升高血尿酸藥物5天進(jìn)行造模，期間并給予低劑量藥物1ml/只進(jìn)行治療;中劑量組給予升高血尿酸藥物5天進(jìn)行造模，期間并給予中劑量藥物1ml/只進(jìn)行治療;高劑量組給予升高血尿酸藥物5天進(jìn)行造模，期間并給予高劑量藥物1ml/只進(jìn)行治療;陽(yáng)性對(duì)照組給予升高血尿酸藥物5天進(jìn)行造模，期間并給予秋水仙堿藥物1ml/只進(jìn)行治療。采用黃嘌呤加鹽酸乙胺丁醇片建立高尿酸血癥小鼠模型。觀察高尿酸血癥小鼠行為變化影響及中藥痛風(fēng)方的干預(yù)作用;中藥痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥小

8、鼠黃嘌呤氧化酶(OXD)活性及血尿酸的影響;高尿酸血癥小鼠SLC2A、SLC22A12抗體的陽(yáng)性表達(dá)率及腎臟形態(tài)學(xué)改變的研究及中藥痛風(fēng)方的干預(yù)作用;觀察高尿酸血癥小鼠SLC2A、SLC22A12基因的改變及中藥痛風(fēng)方的干預(yù)作用;中藥痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥的臨床療效。
　　2、臨床研究
　　收集2010年4月至2012年9月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，以美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1977年制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查，將臨床上已確診為高尿酸

9、血癥的患者病歷64例，隨機(jī)分為痛風(fēng)方治療組和安慰劑對(duì)照組，兩組比例為1∶1，每組32例。予痛風(fēng)方進(jìn)行治療（痛風(fēng)方:蒼術(shù)15g，牛膝10g，黃柏15g，苡仁30 g，川革薢30g，毛冬青30 g，黑老虎10 g，荊芥穗10 g（后下），貓須草30 g，徐長(zhǎng)卿15 g，車前草30 g）。中藥痛風(fēng)方組予以上中藥進(jìn)行治療，對(duì)照組采用安慰劑進(jìn)行對(duì)照，療程5天。觀察患者治療前后血尿酸的變化，在治療前后檢測(cè)患者基本生命體征、ALT、肌酐、尿素氮等的變

10、化，以評(píng)價(jià)治療的安全性。兩組治療結(jié)果進(jìn)行比較，觀察中藥痛風(fēng)方對(duì)血尿酸的影響和療效。
　　上述數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果
　　1.1高尿酸血癥小鼠行為學(xué)變化影響及中藥痛風(fēng)方的干預(yù)作用
　　1.1.1體重
　　各組小鼠體重實(shí)驗(yàn)前未見差異(P＞0.05)，在實(shí)驗(yàn)過程中體重變化不明顯，造模7天當(dāng)中，六組小鼠體重未見明顯增減。造模后

11、各組大鼠體重相似，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析與空白組相比較未見差異(P＞0.05)。
　　1.1.2行為學(xué)
　　實(shí)驗(yàn)前，小鼠狀態(tài)正常，活動(dòng)活躍，沒有明顯病癥。造模第2天上午給予致病藥物的小鼠尿液顏色明顯比正常組小鼠深（呈深黃色），造模第2天下午持續(xù)給予致病藥物可見較空白組小鼠難以抓拿，反抗程度高。造模第3天上午給予治療藥物和陽(yáng)性藥物的組別小鼠比模型組小鼠相對(duì)安靜，但可見活動(dòng)略有異常，造模第3天下午致病藥物小鼠活動(dòng)活躍，狂躁，藥物組與其他組有

12、區(qū)別，相對(duì)安靜但捉拿難。造模第4天上午致病藥物小鼠表征并沒有變化但小鼠相互攻擊增多，有多處傷口。造模第4天下午持續(xù)造模和藥物治療，觀察到模型組與其余組的尿液顏色有差異（呈深黃色）。造模第5天給藥過程中，小鼠的反抗程度仍是比較大，需要大力抓拿，小鼠背部皮膚未見松弛，動(dòng)作相對(duì)敏捷，小鼠表征正常，未見死亡現(xiàn)象。造模第6天小鼠表征正常，不同劑量組的小鼠表現(xiàn)并未明顯差異但高劑量給藥后明顯有不適但持續(xù)時(shí)間并不長(zhǎng)，而陽(yáng)性藥物組別因給藥劑量的少并未見明

13、顯的不良反應(yīng)，持續(xù)使用致病藥物灌胃，模型組相對(duì)正常組食量減少但飲水量增多，小鼠表征并未出現(xiàn)明顯病癥，尿液顏色重。
　　1.2中藥痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥小鼠OXD活性及血尿酸的影響和作用機(jī)制各組小鼠與實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材進(jìn)行OXD活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與空白組相比較，模型組和低劑量組OXD活性明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有及顯著差異(P＜0.01)，中劑量組小鼠OXD活性增強(qiáng)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(P＜0.05)，而空白組與陽(yáng)性藥物組、高劑量組及中

14、劑量組小鼠OXD活性升高不明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)未見差異(P＞0.05)。與模型組相比較，高劑量組和陽(yáng)性藥物組OXD活性明顯偏低，具有極顯著差異(P＜0.01)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血清進(jìn)行尿酸檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與空白組相比較，模型組、中劑量組和低劑量組血尿酸明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有極顯著差異(P＜0.01)，而空白組與高劑量組和陽(yáng)性藥物組則未見差異(P＞0.05)。與模型組相比較，高劑量組和陽(yáng)性藥物組尿酸明顯偏低，統(tǒng)計(jì)具有極顯著差異(P＜0.01)，中

15、劑量組血尿酸相對(duì)偏低，具有差異(P＜0.01)。
　　1.3痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟SLC2A9和SLC22A12蛋白表達(dá)的影響
　　1.3.1 HE染色結(jié)果
　　染色完成后在顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)空白組及高劑量組小鼠腎小球和腎小管處細(xì)胞形態(tài)正常，核膜完整，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，基質(zhì)密度均勻，腎間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞及纖維增生;發(fā)現(xiàn)模型組、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腎小球臟皮上層、近端及遠(yuǎn)端腎小管處細(xì)胞增生，甚

16、出現(xiàn)管型細(xì)胞，間質(zhì)可見單核細(xì)胞浸潤(rùn):高劑量組小鼠腎小球臟皮上層、近端及遠(yuǎn)端腎小管處細(xì)胞小鼠細(xì)胞形態(tài)較正常，與空白組更接近。
　　1.3.2各組小鼠腎細(xì)胞SLC2A9和SLC22A12的蛋白表達(dá)
　　各組小鼠腎細(xì)胞中SLC2A9和SLC22A12的陽(yáng)性表達(dá)均呈棕色，顯微鏡下可以很清晰的看到腎細(xì)胞，蘇木素染核后，核呈現(xiàn)藍(lán)色。SLC2A9的表達(dá):空白組和藥物組棕色較弱，SLC2A9的表達(dá)也較弱，模型組棕色光較強(qiáng)，SLC2A9的表達(dá)

17、增多。SLC22A12的表達(dá)與SLC2A9的表達(dá)的結(jié)果相一致:空白組和藥物組棕色較弱，SLC22A12的表達(dá)也較弱，模型組棕色光較強(qiáng)，SLC22A12的表達(dá)增多。
　　1.4痛風(fēng)方對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟SLC2A9和SLC22A12熒光定量PCR結(jié)果
　　各組小鼠腎組織中SLC2A9和SLC22A12基因的定量結(jié)果如下:空白組SLC2A9的定量結(jié)果較高，模型組的SLC2A9定量結(jié)果偏低，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組小鼠SLC2A9的定

18、量結(jié)果接近空白組，低劑量組和中劑量組SLC2A9的定量處于模型組和空白組之間。SLC22A12的表達(dá)與SLC2A9的表達(dá)的結(jié)果相一致:空白組SLC22A12的定量結(jié)果為較高，模型組的SLC22A12定量結(jié)果較低，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組小鼠SLC22A12的定量結(jié)果接近空白組，低劑量組SLC22A12的定量和模型組接近，中劑量組SLC22A12的定量處于模型組和空白組之間。
　　2、臨床研究結(jié)果
　　64例病例結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究實(shí)際

19、入組病例為61例（脫失病例3例），其中對(duì)照組30例，治療組31例，兩組病例在年齡、身高、體重、吸煙、飲酒、遺傳等方面無(wú)明顯差異(P＞0.05)，具有可比性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示治療組血尿酸治療前、后有明顯差異(P＜0.01)，治療組血尿酸均值低于治療前;而對(duì)照組血尿酸在治療前、后有差異(P＜0.05)，均值反而高于治療前。綜合療效分析:治療組治愈4例，好轉(zhuǎn)24例，無(wú)效3例;治療組治愈率6.6％，有效率80％;對(duì)照組治愈0例，好轉(zhuǎn)6例，無(wú)效24例

20、，有效率9.8％?？傮w療效對(duì)比組間具有差異(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　評(píng)價(jià)其安全性:治療組和對(duì)照組對(duì)患者生命體征、ALT、BUN、CREA均無(wú)明顯影響(P＞0.05);對(duì)照組治療前后未見差異(P＞0.05)。研究中沒有發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1、高尿酸血癥對(duì)小鼠體重的改變不明顯，高尿酸血癥模型小鼠可正常生長(zhǎng)發(fā)育。此外也說明了中藥痛風(fēng)方不會(huì)影響高尿酸血癥小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育。
　　2、高尿酸血癥可

21、導(dǎo)致小鼠行為異常，主要表現(xiàn)為一般情況欠佳，并隨之產(chǎn)生狂躁情緒及敵對(duì)反應(yīng)，這種行為學(xué)的改變是部分可逆的，中藥痛風(fēng)方和秋水仙堿能適當(dāng)改善小鼠異常行為，讓高尿酸血癥小鼠保持皮毛色澤光滑、皮膚彈性、減少敵對(duì)行為和平復(fù)狂躁情緒。
　　3、OXD活性結(jié)果和UA結(jié)果相一致。中藥痛風(fēng)方高、中劑量藥物均能降低高尿酸血癥模型小鼠血尿酸，而中藥痛風(fēng)方高劑量藥物降低血尿酸作用更為明顯，但中藥痛風(fēng)方低劑量藥物則降低血尿酸作用不明顯。
　　4、高尿酸血