xCT缺陷的Sut黑色素細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究目的：
　　 以xCT缺陷的Sut黑色素細(xì)胞為研究對象，以野生型Mela黑色素細(xì)胞為對照，應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究Sut細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，從蛋白質(zhì)組水平上尋找與xCT缺陷相關(guān)的蛋白質(zhì)，為研究xCT缺陷引起的細(xì)胞生長抑制的機理提供實驗支持。
　　 研究方法：
　　 1.Sut和Mela細(xì)胞的培養(yǎng)、收集與總蛋白質(zhì)的制備
　　 Sut和Mela細(xì)胞用含10％胎牛血清，100units/ml雙抗的DM

2、EM/F12培養(yǎng)液，于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞中加入適量裂解液裂解后以1，7000 r/min高速離心45min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。
　　 2.Sut和Mela細(xì)胞總蛋白質(zhì)的二維凝膠電泳及差異蛋白質(zhì)的串聯(lián)質(zhì)譜分析以Bradford方法測定Sut和Mela細(xì)胞的總蛋白濃度，對兩組樣品分別進(jìn)行二維凝膠電泳，應(yīng)用PDQuest軟件分析兩組樣品的二維凝膠電泳圖譜，挑選出Sut細(xì)胞中表達(dá)量明顯變化

3、的蛋白質(zhì)點，對這些蛋白質(zhì)點進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。
　　 3.數(shù)據(jù)庫查詢鑒定差異蛋白質(zhì)
　　 將串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)輸入Mascot軟件，在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索，鑒定出差異蛋白質(zhì)。
　　 4.RT-PCR方法檢測Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平
　　 提取Sut和Mela細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得細(xì)胞cDNA，通過PCR擴增Calmodul

4、in、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的基因，擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠掃描，保存圖像，通過繪制柱狀圖對比Sut細(xì)胞與Mela細(xì)胞mRNA表達(dá)量差異水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.Sut細(xì)胞表達(dá)差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　 比較Sut和Mela細(xì)胞總蛋白質(zhì)的二維凝膠電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)Sut細(xì)胞有20個蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生明顯變化，其中10個蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯上調(diào)，另外10個明顯下調(diào)。對這20個蛋白

5、質(zhì)點進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索查詢，鑒定出這些蛋白質(zhì)。表達(dá)量上調(diào)的10個蛋白質(zhì)分別為：波形纖維蛋白(Vimentin)，肌動蛋白alpha-1b(Tubulin alpha-1b)，肌動蛋白beta-5(Tubulin beta-5)，鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白A3(Annexin A3)，鈣調(diào)素(Calmodulin)，鈣結(jié)合蛋白S100-A4(protein S100-A4)，分子量為11kDa

6、的未知蛋白質(zhì)，鈣結(jié)合蛋白S100-A6(protein S100-A6)，核苷二磷酸激酶B(Nucleosidediphosphate kinase B，NME2)，甲酰谷胱甘肽(S-formylglutathione)；表達(dá)量下調(diào)的10個蛋白質(zhì)分別為：鈣腔蛋白(Calumenin)，N-Myc下游調(diào)控基因1(N-Mycdownstream regulated gene1，NDRG1)蛋白，鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ornithineamino

7、transferase)，二硫鍵異構(gòu)酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3)，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2，DPYSL2)，ATP合成酶ATP5A1(ATP5A1)，H2B組蛋白(Histone H2B type1-K，HISTLH2BK)，分子量為14kDa的未知蛋白質(zhì)，基因序列號為OTTMUSG00000007855的未知蛋白

8、質(zhì)和分子量為47kDa的未知蛋白質(zhì)。
　　 2.RT-PCR方法檢測Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平
　　 通過RT-PCR方法驗證Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平。實驗結(jié)果顯示，和Mela細(xì)胞相比，Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表達(dá)水平在Sut細(xì)胞中

9、明顯上調(diào)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.與Mela細(xì)胞相比，Sut細(xì)胞中有20個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量存在明顯變化，其中10個蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，10個蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)。有3個上調(diào)蛋白質(zhì)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(Vimentin，Tubulin alpha-1b，Tubulin beta-5)，3個上調(diào)蛋白質(zhì)為鈣結(jié)合蛋白(Calmodulin，protein S100A-4，protein S100A-6)，2個上調(diào)蛋白質(zhì)為蛋白酶(S

10、-formylglutathione，Annexin A3)；5個下調(diào)的蛋白質(zhì)為蛋白酶(proteinNDRG1，PDIA3，ATP5A1，Ornithine aminotransferase aminotransfemse，NME2)，2個下調(diào)蛋白質(zhì)為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)(DPYSL2，HISTLH2BK3)。
　　 2.鑒定出的xCT缺陷相關(guān)蛋白質(zhì)在細(xì)胞的自體吞噬、胞內(nèi)囊泡運輸、MAP激酶信號通路，DNA復(fù)制等過程中起到重要作

11、用，推測自體吞噬、MAP激酶信號通路可能在xCT缺陷引起的細(xì)胞生長抑制中起關(guān)鍵作用。自體吞噬、MAP激酶信號通路在Sut細(xì)胞生長抑制中的作用還有待于進(jìn)一步研究。
　　 3.通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，和Mela細(xì)胞相比，Sut細(xì)胞中Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，證明xCT缺陷的Sut細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Calmodulin、Annexin A3、Vimen